血清her－2ECD和cox－2水平與非小細(xì)胞肺癌患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系

陳為軍，仲昭坤，張恩寧，周冬梅，宮新玲

血清her－2ECD和cox－2水平與非小細(xì)胞肺癌患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系

陳為軍＊，仲昭坤，張恩寧，周冬梅，宮新玲

（煙臺市煙臺山醫(yī)院南院腫瘤內(nèi)科二病區(qū)，山東煙臺264000）

目的 探討血清her－2和cox－2濃度與非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）患者臨床病理特征和長期預(yù)后之間的關(guān)系。方法 采用ELISA法檢測非小細(xì)胞肺癌組221例，肺部良性疾病組41例血清中her－2和cox－2濃度，比較不同患者血清her－2和cox－2濃度差異，探討兩者的相關(guān)性及對預(yù)后的影響。結(jié)果 her－2和cox－2在非小細(xì)胞肺癌患者血清水平明顯高于肺部良性疾病患者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05）；且均與腫瘤分期呈正相關(guān)（Spearman秩相關(guān)系數(shù)r分別為：0．830，0．719，P＜0．05）。單因素分析顯示血清her－2和cox－2濃度的表達(dá)均與患者生存有密切關(guān)系（P＜0．05）；多因素分析顯示血清her－2和cox－2濃度均不是影響預(yù)后的獨(dú)立危險因素，而兩者聯(lián)合檢測可預(yù)測病人的預(yù)后相對危險度為1．5（1．08－2．09）。結(jié)論 非小細(xì)胞肺癌患者血清中her－2和cox－2陽性表達(dá)明顯相關(guān)。兩者的聯(lián)合檢測有助于非小細(xì)胞肺癌的預(yù)后評估。

非小細(xì)胞肺癌；her－2；cox－2；ELISA

（Chin J Lab Diagn，2014：18：0227）

我國城市中肺癌病死率位居惡性腫瘤之首，非小細(xì)胞肺癌占肺癌發(fā)病率的80%，近年來對非小細(xì)胞肺癌的分子生物學(xué)的研究越來越深入。Her－2在NSCLC的表達(dá)率為16%－57%，部分研究結(jié)果顯示her－2的高表達(dá)與NSCLC的預(yù)后相關(guān)，外周血可測得her－2胞外域蛋白（ECD）［1］。Cox－2是近年被關(guān)注的腫瘤靶點，在多種腫瘤包括NSCLC高表達(dá)，有研究結(jié)果提示高表達(dá)與預(yù)后差相關(guān)，但結(jié)論不一［2］。其中兩者在非小細(xì)胞肺癌中的研究多集中于免疫組化層面，而采用血清進(jìn)行研究的卻鮮有報道，兩者均可在外周血中測得，本研究采用ELISA法定量檢測非小細(xì)胞肺癌患者治療前血清her－2與cox－2水平，觀察治療前血清中兩者的水平是否可判斷病人的預(yù)后，進(jìn)一步驗證兩者在血清中表達(dá)是否具有相關(guān)性。

1 材料與方法

1．1 臨床資料

收集2008年1月至2009年12月在山東省煙臺市煙臺山醫(yī)院腫瘤內(nèi)科住院的非小細(xì)胞肺癌患者共221例，入組之前未經(jīng)過任何治療，詳細(xì)記錄年齡、分期、相關(guān)化驗指標(biāo)等臨床資料。選取41例肺部良性疾病作為對照組，其中肺部感染性疾病6例，慢性阻塞性肺疾病19例，支氣管哮喘16例。隨訪截止日期為2012年12月，中位隨訪時間為3年零7個月。

1．2 樣本采集及保存

非小細(xì)胞肺癌組及對照組均于治療前清晨抽取空腹靜脈血，均為一式三份，3 000r／min離心10 min，取上層血清存于－20℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1．3 試劑和方法

采用雙抗體夾心ELISA法檢測兩者在血清中的濃度，試劑盒均購自美國ADL公司，實驗步驟嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。

1．4 判定標(biāo)準(zhǔn)

血清her－2及cox－2陽性判定標(biāo)準(zhǔn)：以血清her－2／neu濃度≥15ng／ml為陽性，＜15ng／ml為陰性；cox－2≥11．90ng／ml為陽性，＜11．90ng／ml為陰性。兩者陽性值均為正常值上限。

1．5 統(tǒng)計學(xué)處理

用SPSS13．0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，使用Kaplan–Meier法進(jìn)行生存分析，使用Wilcoxon秩和檢驗和log－rank檢驗進(jìn)行單因素分析，使用Cox回歸模型進(jìn)行多因素分析。定量資料采用_x±s表示，兩變量相關(guān)關(guān)系采用Pearson相關(guān)分析，與腫瘤分期的關(guān)系采用Spearman秩相關(guān)分析，檢驗水準(zhǔn)α＝0．05。

2 結(jié)果

2．1 單因素分析

病人的臨床資料及單因素分析結(jié)果詳細(xì)總結(jié)于表1。

采用Wilcoxon秩和檢驗對入組病人進(jìn)行單因素分析（見表1），發(fā)現(xiàn)有以下臨床特點的病人生存期相對較短（P＜0．05）：ECOG評分≥2分；腫瘤大小及局部浸潤范圍分期為T3－T4；淋巴結(jié)受累情況分期為N1－N3；存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者；血清白細(xì)胞計數(shù)＞10＊109者；血清her－2／neu濃度≥15ng／ml者；血清cox－2≥11．90ng／ml者。由此可認(rèn)為血清her－2和cox－2濃度的表達(dá)均與患者生存有密切關(guān)系。

log－rank檢驗不同濃度her－2和cox－2患者的生存率曲線分布差別有統(tǒng)計學(xué)意義，χ2＝18．41，P＝0．004；χ2＝10．31，P＝0．01；顯示根據(jù)治療前血清her－2繪制的生存概率見圖1，顯示血清her－2陽性者預(yù)后差；根據(jù)治療前血清cox－2繪制的生存概率見圖2，顯示血清cox－2陽性者預(yù)后差。

表1 病人臨床資料及單因素分析

圖1 血清her－2分組的累計生存率曲線

2．2 多因素分析

圖2 血清cox－2分組的累計生存率曲線

多因素分析顯示，以下臨床特點為獨(dú)立的預(yù)后不良因素（相對危險度及95%可信區(qū)間）：ECOG評分≥2分：2．28（1．59－3．27）；有淋巴結(jié)受累者2．0（1．38－2．99）；存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者1．48（1．04－2．09）。血清her－2與cox－2水平均不能單獨(dú)成為非小細(xì)胞肺癌的獨(dú)立預(yù)后因素，而兩者聯(lián)合檢測可預(yù)測病人的預(yù)后1．5（1．08－2．09）

2．3 血清her－2與cox－2水平（見表2）

2．3．1 血清her－2與cox－2水平：Wilcoxon秩和檢驗發(fā)現(xiàn)兩者在非小細(xì)胞肺癌組水平均高于肺部良性病變組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05）；進(jìn)一步亞組分析提示兩者與腫瘤分期呈正相關(guān)（Spearman秩相關(guān)系數(shù)r分別為：0．830，0．719，P＜0．05）。

表2 兩組Her－2、Cox－2水平比較

2．3．2 非小細(xì)胞肺癌組血清her－2與cox－2水平的關(guān)系：呈正相關(guān)關(guān)系，Pearson相關(guān)系數(shù)r＝0．717，P＜0．05。

3 討論

既往關(guān)于her－2和cox－2的研究大多依賴于組織標(biāo)本或細(xì)胞系，臨床應(yīng)用具有一定限制，本研究應(yīng)用ELISA法定量檢測非小細(xì)胞肺癌患者化療前血清her－2與cox－2水平，該方法簡便易行，患者容易接受，臨床可操作性強(qiáng)，可以方便快捷地對非手術(shù)病人進(jìn)行有效地評估及監(jiān)測，為相應(yīng)的靶向治療提供依據(jù)，而且便于基層醫(yī)院開展。

her－2／neu基因是人類表皮生長因子受體（EGFR）家族的第2個成員，定位于人染色體17q21，包括信號肽、胞外區(qū)、胞漿區(qū)和跨膜區(qū)，其中胞外區(qū)（extra－cellular domain，ECD）相對分子質(zhì)量為（97－115）×103kD，可被基質(zhì)金屬蛋白酶切割進(jìn)入外周血［3］。her－2在正常情況下處于非激活狀態(tài)，與其特異性抗體結(jié)合后可調(diào)節(jié)細(xì)胞的分裂、分化和增殖，當(dāng)受到某些致癌因素的作用后，其結(jié)構(gòu)或表達(dá)調(diào)控失常，轉(zhuǎn)而具有腫瘤轉(zhuǎn)化活性，可促使細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，并通過阻止腫瘤細(xì)胞凋亡及促進(jìn)腫瘤新生血管的生成等途徑促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長及轉(zhuǎn)移［4－5］。her－2癌基因擴(kuò)增或蛋白過量表達(dá)，可見于人類大部分腫瘤組織中［5，6］。既往研究多集中于免疫組化層面，在非小細(xì)胞肺癌中血清her－2的研究鮮有報道，有研究［7］表明，正常人群血清中存在由細(xì)胞表面脫落的her－2／neu的細(xì)胞外區(qū)ECD片段，但水平較低（＜15ng／ml）；國內(nèi)外、相關(guān)研究顯示血清her－2含量與免疫組化監(jiān)測癌組織中her－2／neu的表達(dá)水平呈正相關(guān)［8－10］。本實驗發(fā)現(xiàn)，約有20%的非小細(xì)胞肺癌患者血清her－2呈陽性表達(dá)，且與TNM分期呈正相關(guān)，對病人進(jìn)行隨訪發(fā)現(xiàn)該部分患者預(yù)后較差，這與目前大部分在免疫組化層面的研究結(jié)果一致［11，12］。

環(huán)氧化酶－2（Cyclooxygenase－2，cox－2）的基因為誘導(dǎo)表達(dá)型基因，在正常組織中多不表達(dá)或低表達(dá)，但在炎癥、腫瘤等情況下，細(xì)胞受誘導(dǎo)而大量表達(dá)cox－2。目前研究表明，在絕大多數(shù)腫瘤組織中均有cox－2表達(dá)，其主要通過影響腫瘤細(xì)胞的增殖與分化、抑制腫瘤細(xì)胞凋亡、影響細(xì)胞周期、促進(jìn)腫瘤血管生成等多個途徑在腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移過程中起著重要作用［13－15］。文獻(xiàn)顯示，在幾乎所有NSCLC均表達(dá)cox－2，并呈廣泛的中等強(qiáng)度表達(dá)［15］，其陽性表達(dá)率又以腺癌最高［14］，同時與腫瘤臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)［16－18］。同樣，既往研究多集中于免疫組化層面，近年來相關(guān)研究提示，血清cox－2表達(dá)情況與肺癌組織中cox－2表達(dá)情況呈正相關(guān)［19］。本實驗發(fā)現(xiàn)非小細(xì)胞肺癌患者血清中cox－2表達(dá)陽性率為53．8%，進(jìn)一步亞組分析提示在Ⅰ、Ⅱ期患者中血清cox－2表達(dá)量與對照組比較有顯著差異，說明cox－2是肺癌發(fā)生的早期事件。同時，在Ⅲ＋Ⅳ期患者高于I＋Ⅱ期患者，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組。以上均說明cox－2表達(dá)與TNM分期、轉(zhuǎn)移正相關(guān)。同樣，對病人進(jìn)行隨訪發(fā)現(xiàn)，血清cox－2表達(dá)陽性的非小細(xì)胞肺癌病人預(yù)后較差。

在免疫組化層面，國內(nèi)外已有多項研究證實兩者為非小細(xì)胞肺癌的預(yù)后因素，同時證實兩者之間存在相關(guān)性。目前研究認(rèn)為，her－2與cox－2兩條通路之間存在交叉和相互作用，her－2可上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）及血管通透因子的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤新生血管的生成，而由cox－2催化合成的前列腺素本身就是一種血管通透因子，可能作為血管生成劑促進(jìn)腫瘤的形成。Benoit等［20］發(fā)現(xiàn)her－2可通過不同的機(jī)制來誘導(dǎo)cox－2的轉(zhuǎn)錄，her－2狀態(tài)可能是cox－2表達(dá)的一個決定性因素，her－2可通過Ras—Raf—MEK—MAPK—AP一1／PEA3信號傳導(dǎo)通路，誘導(dǎo)cox－2的轉(zhuǎn)錄。同時，cox－2對her－2的表達(dá)還存在反向調(diào)節(jié)，cox－2及PGE2可能通過cAMP介導(dǎo)上調(diào)her－2的表達(dá)。本實驗提示，NSCLC患者血清中her－2與cox－2陽性表達(dá)呈一致性，進(jìn)一步驗證了上述各種研究結(jié)果，而且統(tǒng)計學(xué)分析提示兩者均不能單獨(dú)成為非小細(xì)胞肺癌的獨(dú)立預(yù)后因素，而兩者聯(lián)合檢測可預(yù)測病人的預(yù)后，提示在NSCLC中her－2與cox－2存在相互調(diào)控機(jī)制共同促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。我們還發(fā)現(xiàn)在非小細(xì)胞肺癌患者血清中，her－2與cox－2皆為陽性者比兩者皆為陰性者，臨床分期晚、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率高；同時，對入組病人進(jìn)行隨訪發(fā)現(xiàn)：her－2與cox－2皆陽性表達(dá)病人，無論是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，生存率都差，提示her－2與cox－2共同作用可能會誘導(dǎo)轉(zhuǎn)移，影響預(yù)后。以上分析提示，在NSCLC患者血清中her－2與cox－2皆為陽性者預(yù)后差。因此，結(jié)合本實驗結(jié)果我們推測her－2與cox－2抑制劑聯(lián)合使用可能使此類人群獲益。

綜上所述，通過ELISA法檢測血清her－2與cox－2水平，可以方便快捷的對非小細(xì)胞肺癌病人進(jìn)行評估及監(jiān)測，具有取材簡便，操作簡單，便于基層醫(yī)院開展等優(yōu)點，有可能通過動態(tài)觀察指標(biāo)變化來早期發(fā)現(xiàn)疾病進(jìn)展，間接判定療效、預(yù)后等。同時ELISA法客觀性較強(qiáng)，也可為her－2與cox－2的靶向治療提供依據(jù)，指導(dǎo)臨床治療。隨著科技的不斷發(fā)展，相信應(yīng)用ELISA法對血清中her－2與cox－2的濃度進(jìn)行聯(lián)合檢測將為腫瘤研究及臨床治療開辟新徑。

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Serum levels of her－2 and cox－2in patients with non－small cell lung cancer and the clinical significance

CHEN Wei－jun，ZHONG Zhao－kun，ZHANG En－ning，et al．
（The Second Ward Section，Department of Medical Oncology，Yantaishan Hospital，Yantai 264000，China）

Objective To investigate the correlations of serum her－2and cox－2levels with clinical pathological characteristics and Long－term prognosis in patients with non－small cell lung cancer（NSCLC）．Methods Enzyme－linked immunoadsorbent assay（ELISA）was used to detect the levels of her－2and cox－2in the serum samples collected from 221 NSCLC patients and 41controls．The concentrations of her－2and cox－2were compared between different patients，and there correlations as well as their influences on prognosis were also analyzed．Results The levels of serum her－2and cox－2were significantly higher in the NSCLC patients than those in the controls（P＜0．05），which were also positively correlated tumor stages（Spearman＇s rank correlation coefficient r：0．830，0．719，P＜0．05）．Univariate analysis showed that serum concentrations of both her－2and cox－2expression were closely correlated with survivals of the patients（P＜0．05）．Multi－factor analysis showed that both her－2and cox－2concentrations in the serum were not independent risk factors influencing prognosis，but their combination can predict the prognosis of patients 1．5（1．08－2．09）．Conclusion Serum levels of her－2and cox－2expression are significantly correlated in NSCLC patients，and combined detection for their expression may be of important value in judgment of prognosis．

non－small cell lung cancer；her－2；cox－2；ELISA

R734．2

A

陳為軍，男，32歲，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：肺癌的綜合治療。

2013－04－10）

1007－4287（2014）02－0227－04

煙臺市科學(xué)技術(shù)發(fā)展計劃項目（項目編號：2009156－3）

＊通訊作者