2型糖尿病視網膜病變患者外周血單個核細胞中PEDF與TNF-α水平的變化*

呂秋菊，唐喜香，丘雅維，曾可靜，穆攀偉，陳燕銘，曾龍驛

(中山大學附屬第三醫院內分泌與代謝病科，廣東廣州 510630)

2型糖尿病視網膜病變患者外周血單個核細胞中PEDF與TNF-α水平的變化*

呂秋菊，唐喜香，丘雅維，曾可靜，穆攀偉，陳燕銘△，曾龍驛

(中山大學附屬第三醫院內分泌與代謝病科，廣東廣州 510630)

目的:色素上皮衍生因子(PEDF)是影響糖尿病視網膜病變(DR)發生發展的重要因子，本研究觀察2型糖尿病視網膜病變患者外周血單個核細胞(PBMCs)中PEDF、磷酸化NF-κB p65及TNF-α的表達，探討DR的發病機制。方法：選取2011年10月～2013年4月在我院內分泌科住院確診為2型糖尿病的患者(DM組)108例，并根據眼底造影結果將患者分為無糖尿病視網膜病變組(NDR組)52例和糖尿病視網膜病變組(DR組)56例，同期糖耐量實驗正常者52例作為對照組(NC組)。密度梯度離心法收集患者PBMCs，提取總蛋白，Western blotting檢測3組患者PBMCs中PEDF、磷酸化NF-κB p65和TNF-α蛋白表達水平，ELISA測定血漿PEDF與TNF-α水平，收集患者體檢指標并測量患者生化指標。結果:Western blotting檢測結果顯示NDR組和DR組PEDF、磷酸化NF-κB p65和TNF-α蛋白水平明顯高于NC組(P＜0.05);DR組TNF-α蛋白水平明顯高于NDR組(P＜0.05)，DR組PEDF及磷酸化NF-κB p65蛋白水平略高于NDR組，差異無統計學意義(P＞0.05);NDR組和DR組血漿PEDF與TNF-α水平均明顯高于NC組(P＜0.05)，DR組明顯高于NDR組(P＜0.05)。在糖尿病組，血漿PEDF水平與TNF-α及血尿酸水平呈正相關(r=0.39，r=0.25，P＜0.05)。結論:本研究首次證實PBMCs中可表達PEDF;2型糖尿病患者PBMCs中PEDF表達水平增加，TNF-α及血漿PEDF的表達水平上調，PEDF可能通過與炎癥因子TNF-α相互作用影響DR發生發展。

色素上皮衍生因子;外周血單個核細胞;糖尿病視網膜病

糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病常見的微血管并發癥，是當今勞動適齡人口致盲的主要原因之一。明確DR發病機制對預防和控制DR有重要作用。近年來，大量研究認為，早期DR的發生發展與局部慢性低度炎癥狀態密切相關［1］。外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)主要由單核細胞和淋巴細胞組成，在炎癥反應中起重要作用。DR逐漸發生時，PBMCs炎癥狀態是否發生改變，目前報道甚少。色素上皮衍生因子(pigment epithelium-derived factor，PEDF)是一種分子量為50 kD的分泌型糖蛋白，其作用與DR發生過程中血管新生和炎癥反應密切相關。PEDF主要由肝臟和脂肪細胞［2］分泌，在糖尿病及其并發癥發生過程中起著重要作用，目前尚未見任何關于PBMCs分泌PEDF的報道。本研究旨在探討DR患者與非糖尿病視網膜病變(non-diabetic retinopathy，NDR)患者外周血單個核細胞中PEDF、磷酸化核轉錄因子κB(phosphorylated nuclear factor κB，p-NF-κB)及腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)蛋白表達的差異，為DR與炎癥之間關系進行進一步深入的探討提供線索。

材料和方法

1 研究對象及材料

1.1 對象選取我院2011年10月～2013年4月診斷為2型糖尿病(diabetes mellitus，DM)的患者108例，其中男55例，女53例，年齡(59.3±9.7)歲，糖尿病診斷符合WHO 1999年標準。根據眼底熒光血管照影和眼底檢查結果，將糖尿病患者分為2組:糖尿病不合并視網膜病變患者(NDR組)52例，年齡(56.3±7.1)歲，糖尿病合并視網膜病變患者(DR 組)56例，年齡(62.2±10.9)歲。正常對照(normal control，NC)組選擇體檢健康者52例，男23例，女29例，年齡(56.4±11.8)歲，無心臟病、高血壓，口服葡萄糖耐量實驗(oral glucose tolerance test，OGTT)排除糖尿病。研究對象均無明確的心、肝、肺及腎臟疾病，排除急、慢性感染性疾病及惡性腫瘤等。

1.2 材料與試劑Lymphoprep人淋巴細胞分離液購自達科為公司;細胞裂解液購自廣州捷倍斯公司;蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑和BCA蛋白濃度測定試劑盒均購自Pierce;PVDF膜購自Millipore;兔抗人PEDF多抗購自Santa Cruz，兔抗人磷酸化NF-κB p65單抗、兔抗人TNF-α單抗和β-actin單抗均購自Cell Signaling Technology。熒光標記的羊抗兔II抗購自Odyssey。

2 方法

2.1 一般檢查對所有受試者詢問病史、家族史、吸煙史，測量血壓、心率、身高、體重等，檢測血常規和尿常規。

2.2 血漿PEDF及TNF-α水平檢測血漿PEDF及TNF-α水平采用酶聯免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)測定，試劑盒購自Millipore和安迪生物科技上海有限公司，操作均嚴格按照試劑盒說明書的要求步驟進行。

2.3 Western blotting檢測PBMCs中PEDF、TNF-α 和p-NF-κB p65(Ser536)蛋白水平收集病人清晨空腹靜脈血3 mL，2 h內以Ficoll淋巴細胞分離液密度梯度離心法分離PBMCs，加入細胞裂解液后，4℃、16 000×g離心15 min取上清液即可得總蛋白，BCA法測蛋白濃度，配平蛋白濃度。每樣品取15 μL上樣，SDS-PAGE約2 h，用電轉移法將蛋白轉移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉或5%BSA室溫封閉2 h，加入兔抗人PEDF多抗、兔抗人p-NF-κB p65單抗、兔抗人TNF-α單抗或兔抗人β-actin單抗(1∶1 500) 4℃過夜。經熒光標記的羊抗兔II抗(1∶10 000)室溫孵育1 h后洗膜，將膜置于Odyssey近紅外光熒光掃描儀上進行掃描。以目的蛋白與β-actin條帶吸光度值之比表示目的蛋白表達水平。

3 統計學處理

采用SPSS 13.0分析，計數資料用卡方檢驗，計量資料行正態性檢驗，符合正態分布的數據以均數±標準差(mean±SD)表示，非正態數據以中位數(第1四分位數，第3四分位數)［median(Q1，Q3)］表示。對于符合正態分布、方差齊的數據，組間比較采用單因素方差分析，相關性采用Pearson相關分析。對于非正態分布或方差不齊的數據，組間比較采用秩和檢驗，相關性采用Spearman相關分析。以P＜0.05(雙側)為差異有統計學意義。

結果

1 臨床基本資料

3組間患者性別及年齡差異無統計學意義(P＞0.05);DR組血尿酸(serum uric acid，SUA)水平較NC組及NDR組高，差異有統計學意義(P＜0.05); DR組和NDR組白細胞(white blood cell，WBC)計數較NC組高，差異有統計學意義(P＜0.05)，見表1。

表1 各組臨床資料與實驗室指標Table 1.Clinical and experimental characteristics among the three groups

2 PBMCs中p-NF-κB p65(Ser536)、PEDF和TNF-α蛋白的表達水平

PBMCs可表達p-NF-κB p65(Ser536)、PEDF和TNF-α蛋白。NDR組和DR組患者PBMCs中p-NF-κB p65(Ser536)蛋白水平顯著高于NC組，差異有統計學意義(P＜0.05);DR組患者PBMCs中p-NF-κB p65(Ser536)蛋白水平略高于NDR組，但差異無統計學意義(P＞0.05)。NDR組及DR組患者PBMCs 中PEDF蛋白水平明顯高于NC組，差異有統計學意義(P＜0.05);DR組略高于NDR組，但差異無統計學意義(P＞0.05)。NDR組及DR組患者PBMCs中TNF-α蛋白水平明顯高于NC組，差異有統計學意義(P＜0.05)，DR組明顯高于NDR組，差異有統計學意義(P＜0.05)，見圖1。

3 血漿PEDF與TNF-α水平

血漿PEDF水平在NDR組［(2.46±0.71)mg/ L］和DR組［(2.82±0.62)mg/L］明顯高于NC組［(2.04±0.65)mg/L］，差異有統計學意義(P＜0.05)，DR組明顯高于NDR組，差異有統計學意義(P＜0.05)。血漿TNF-α水平在NDR組［(66.72± 21.18)ng/L］和DR組［(78.03±23.30)ng/L］明顯高于NC組［(53.82±23.69)ng/L］，差異有統計學意義(P＜0.05)，DR組明顯高于NDR組，差異有統計學意義(P＜0.05)，見圖2。

4 相關性分析

患者血漿PEDF水平與TNF-α及SUA水平均呈顯著正相關(r值分別為0.39和0.25，P＜0.05)。血漿PEDF水平與患者年齡無明顯相關性。

Figure 1.Protein levels of p-NF-κB p65(Ser536)，PEDF and TNF-α in PBMCs among the three groups.NC:normal control subjects(n=52);NDR:non-diabetic retinopathy patients(n=52);DR:diabetic retinopathy patients(n=56).Mean±SD.*P＜0.05 vs NC group;#P＜0.05 vs NDR group.圖1 各組PBMCs中p-NF-κB p65(Ser536)、PEDF和TNF-α蛋白的表達水平

討論

PEDF是1989年Tombran-Tink等［3］首次從胎兒視網膜色素上皮細胞培養液中提取出的一種蛋白因子，是由418個氨基酸構成的分泌性糖蛋白，分子量約50 kD，屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑超家族成員，但并不具有抑制劑活性。PEDF是血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的拮抗因子，除了其強烈的抗血管新生作用［4］之外，其抗炎作用也逐漸受到重視［2，5］。Zhang等［6］的研究發現，糖尿病視網膜病變及氧誘導的視網膜病變小鼠玻璃體內注射PEDF后，炎癥因子水平如VEGF、TNF-α、單核細胞趨化蛋白1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)、細胞間黏附分子1(intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1)等均下降，而小分子RNA干擾PEDF表達后，炎癥因子水平上升。近年多項研究提示，DR的發生發展與慢性炎癥密切相關［7］。PBMCs主要由單核細胞和淋巴細胞組成，T淋巴細胞激活，可直接損傷胰島細胞，促發1型糖尿病［8］;過度肥胖時，單核細胞激活后轉化為巨噬細胞，聚集到脂肪組織釋放如TNF-α、白細胞介素6 (interleukin-6，IL-6)等炎癥介質，介導和參與炎癥反應，引起胰島素抵抗，逐漸進展為2型糖尿病。隨著炎癥介質刺激的累積，視網膜血管損傷、增生，進而發展為視網膜病變［9］。因此，PBMCs是研究糖尿病發生機制的重要對象。本研究首次發現，PEDF可表達于人PBMCs，并在糖尿病患者PBMCs中明顯增高，且DR組高于NDR組。同時DR組和NDR組血漿PEDF水平明顯高于NC組，與PBMCs蛋白表達水平趨勢一致，但DR組血漿PEDF水平明顯高于NDR組，可能由于血漿中PEDF是所有分泌器官分泌PEDF的總和，PBMCs分泌的PEDF量只占其中一部分，因此差異不如血漿PEDF變化顯著。另2項日本的人群研究發現［10-11］，NDR組血清PEDF與NC組及DR組差異不明顯，可能是2項研究中NDR組的樣本量均較少(＜18例)有關。結合我們的研究分析，PBMCs是分泌PEDF的重要器官，其PEDF分泌量的變化可能影響血漿PEDF濃度，并隨著糖尿病并發癥的發生而逐漸升高。這提示血漿PEDF在2型糖尿病組尤其糖尿病視網膜病變組明顯增高可能預示糖尿病視網膜病變的發生發展。

Figure 2.Levels of PEDF and TNF-α in plasma among the three groups.NC:normal control subjects(n=52);NDR: non-diabetic retinopathy patients(n=52);DR:diabetic retinopathy patients(n=56).Mean±SD.*P＜0.05 vs NC group;#P＜0.05 vs NDR group.圖2 各組血漿PEDF和TNF-α水平

NF-κB p65是核轉錄因子蛋白NF-κB的亞基，在炎癥反應中起重要作用，以二聚體的形式與其抑制因子IκB結合以無活性的形式存在于胞漿中，炎癥、營養過剩、內質網應激等多種因素激活NF-κB p65，激活的NF-κB p65進入細胞核，增強多種炎癥因子如TNF-α、IL-1、IL-6、干擾素γ(interferon-γ，IFN-γ)的轉錄和表達，而產生的細胞因子如TNF-α反過來激活NF-κB p65，形成正反饋，增強炎癥反應［12］。研究發現，新診斷2型糖尿病患者PBMCs中p-NF-κB p65蛋白表達水平明顯高于正常對照組［13］。本研究進一步發現糖尿病患者PBMCs中p-NF-κB p65 和TNF-α蛋白表達水平在DR組高于NDR組。TNF-α主要由單核-巨噬細胞分泌，而單核細胞是PBMCs的主要組成部分，PBMCs激活時TNF-α分泌增多。我們前期的研究發現，DR患者血清TNF-α水平較NDR患者明顯升高［14］，與本實驗PBMCs中TNF-α趨勢相同，提示DR患者較NDR患者處于更嚴重的炎癥狀態，這種炎癥狀態的加重可能與PBMCs激活有關。

本研究還發現，血漿PEDF水平與TNF-α及SUA呈正相關。其中，TNF-α是重要的炎癥介質［15］，尿酸被認為與慢性低度炎癥呈正相關［16］。本研究結果提示血漿PEDF可能隨炎癥程度的加重而升高。

糖尿病是一種慢性炎癥性疾病，隨著長期高糖刺激，糖尿病患者微血管結構和功能發生改變，逐步發展為DR。多項研究提示炎癥參與了DR的發病機制。本研究中，隨著DR的發生，PBMCs中炎癥轉錄因子p-NF-κB p65及炎癥因子TNF-α蛋白表達水平升高，提示PBMCs炎癥狀態的改變可能與DR的發生發展有關，而這種炎癥狀態的改變可能是由于各種因素如長期高糖、血糖波動、缺血缺氧等刺激PB-MCs中NF-κB p65磷酸化激活炎癥通路引起的;PBMCs中PEDF表達隨TNF-α的上升而增高，可能是炎癥激活某種通路的結果，具體的作用機制尚需進一步研究。同時，血漿PEDF水平升高，與具促炎效應的SUA及TNF-α呈正相關，說明PEDF與炎癥關系密切。但其在糖尿病視網膜病變發病過程中與炎癥的關系尚不明確。多項研究表明，PEDF具有抗炎作用，PEDF過表達轉基因小鼠研究發現，高氧誘導缺血性視網膜病變和激光誘導視網膜病理血管增生時，轉基因小鼠視網膜缺血缺氧程度及炎癥因子表達水平均明顯低于野生型小鼠［17］，而PEDF基因敲除小鼠則出現相反的表現［18］，提示PEDF通過抑制炎癥及視網膜血管新生延緩視網膜病變的發生發展。而一些臨床研究結果表明，PEDF與血清炎癥因子水平呈正相關［19］，可能是由于機體的代償反應機制，即DR期炎癥因子分泌的增加引起機體對PEDF需求量增加，從而代償性升高以拮抗炎癥反應。而DR發生時，由于視網膜血管閉塞及缺血，導致視網膜局部血流減少，致視網膜PEDF量下降。PBMCs在此過程中可能起著重要作用，其主要成分單核細胞在活化時可到達視網膜局部釋放PEDF，抑制視網膜病變的發展。而視網膜局部血流量下降時，所能激活的PBMCs數量有限，導致視網膜局部PEDF水平下降。這可能是DR患者視網膜局部PEDF減少而外周血PEDF升高的原因。但引起外周血PEDF增高的具體機制及PEDF與NF-κB p65活化及TNF-α之間的因果關系尚需進行下一步深入研究。

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Levels of PEDF and TNF-α in PBMCs of type 2 diabetic retinopathy patients

Lü Qiu-ju，TANG Xi-xiang，QIU Ya-wei，ZENG Ke-jing，MU Pan-wei，CHEN Yanming，ZENG Long-yi
(Department of Endocrinology＆Metabolism，The Third Affiliated Hospital，Sun Yat-sen University，Guangzhou 510630，China.E-mail:yanmingch@tom.com)

AIM:To investigate the roles of pigment epithelium-derived factor(PEDF)，phosphorylated NF-κB p65 and TNF-α in peripheral blood mononuclear cells(PBMCs)in diabetic retinopathy(DR)patients.METHODS:Fifty-two healthy persons were enrolled in the study as normal control group(NC group).Type 2 diabetic patients served as DM group(n=108)，which were sub-divided into non-diabetic retinopathy group(NDR group，n=52)and diabetic retinopathy group(DR group，n=56)by angiography.The PBMCs were isolated by the technique of density-gradient centrifugation.The protein levels of PEDF，phosphorylated NF-κB p65 and TNF-α in the PBMCs were determined by Western blotting.The levels of plasma PEDF and TNF-α were detected by ELISA.The content of serum uric acid(SUA)and white blood cell count were measured.RESULTS:The levels of PEDF，TNF-α and phosphorylated NF-κB p65 in the PBMCs were statistically higher in NDR group and DR group than those in control group.The level of TNF-α increased significantly in DR group as compared with NDR group.The levels of PEDF and phosphorylated NF-κB p65 were slightly but not significantly higher in DR group than those in NDR group.The plasma levels of PEDF and TNF-α were evidently elevated in NDR group and DR group compared with NC group，and those were obviously higher in DR group than those in NDR group.In the diabetic patients，the plasma level of PEDF was positively correlated with the levels of TNF-α(r=3.39，P＜0.05) and SUA(r=0.25，P＜0.05).CONCLUSION:The expression of PEDF in PBMCs is markedly increased，accompanied with the elevation of phosphorylated NF-κB p65 and TNF-α in type 2 diabetic patients especially with DR，suggesting that PEDF is possibly involved in the development of DR by inflammatory mechanism.

Pigment epithelium-derived factor;Peripheral blood mononuclear cells;Diabetic retinopathy

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2014.02.020

1000-4718(2014)02-0308-05

2013-09-26

2013-12-30

廣東省科技計劃(No.2011B031800155);廣東省自然科學基金資助項目(No.S2011010004811)

△通訊作者Tel:020-85253408;E-mail:yanmingch@tom.com