RCCS模擬微重力對銅綠假單胞菌莫西沙星敏感度的影響

黃玉玲 易 勇 楊建武 江文俊 賈莉萍 楊鶴鳴 周金蓮 崔 彥 徐冰心

隨著航天事業的迅猛發展，太空感染問題亟待深入研究。隨宇航員和太空飛行器進入太空的微生物，在失重環境下其生物學性狀發生變化，時刻威脅著宇航員的健康及飛行器的安全[1，2]。銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginos)是一種常見的條件性致病菌，阿波羅13號宇宙飛船執行任務過程中，曾有宇航員發生銅綠假單胞菌引起的泌尿系統感染[3]。Crabbé等[4，5]通過模擬微重力和飛船搭載菌株研究發現，銅綠假單胞菌藻酸鹽、彈性蛋白酶、鼠李糖脂產生增加，其中銅綠假單胞菌POA1菌株有330種基因表達水平高于對照組1.5倍以上，涉及多種應激反應蛋白的合成、致病因子的表達、各種生理代謝的物質合成等。目前尚無微重力環境下銅綠假單胞菌藥物敏感度方面的研究報道。本研究采用三維細胞培養系統(rotary cell culture system，RCCS)研究模擬微重力環境對銅綠假單胞菌莫西沙星敏感度的影響，旨在為航天員的醫監醫保提供參考依據。

材料與方法

1.主要試劑和儀器:銅綠假單胞菌ATCC 27853(中國普通微生物菌種保藏管理中心)，LB培養基和MH肉湯培養基(北京奧博星生物技術有限責任公司)，鹽酸莫西沙星注射液(拜耳醫藥保健有限公司)，莫西沙星藥敏紙片(北京天壇藥物生物技術開發公司)，SYTO-9(美國Sigma公司)，PI(美國Sigma公司)，全溫震蕩培養箱(太倉市實驗設備廠)，RCCS(美國Synthecon公司)，恒溫恒濕培養箱(黃石市恒豐醫療器械有限公司)，濁度計(法國生物梅里埃公司)，FACS Calibur型流式細胞儀(美國BD公司)。

2.實驗分組和模擬微重力細菌培養:參照文獻[3～5]，將銅綠假單胞菌ATCC 27853劃線接種于血平板上，37℃過夜培養;取單一菌落，接種于新鮮LB液體培養基中，220r/min過夜培養。取50μl過夜菌懸液接種于5ml新鮮LB培養基中，振蕩培養至對數生長期，新鮮LB培養基調整菌液終濃度為103。新鮮LB培養基浸洗細胞培養瓶10min，棄廢液;菌液加注到50ml培養瓶中，排空氣泡。將培養瓶安置于RCCS上，實驗組(模擬微重力組)培養瓶軸心與地面平行，對照組(地面重力組)培養瓶軸心與地面垂直，詳見圖1。于25r/min、37℃下持續培養;每24h更換培養基，過程中注意嚴格無菌操作，分別于培養第1、7、14天取實驗組和對照組適量菌液，檢測莫西沙星藥物敏感度。

圖1 RCCS模擬微重力環境及重力環境的實現

3.肉湯稀釋法檢測最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC):用試管二倍稀釋法測定莫西沙星對實驗組和對照組銅綠假單胞菌ATCC 27853的MIC，操作規范參照CLSI(M100-S22，2012)標準[6]。

4.K-B紙片法檢測抑菌環直徑:0.5麥氏單位菌懸液用無菌棉拭均勻涂布于M-H培養基，貼莫西沙星藥敏紙片后置37℃孵箱培養24h，精確量取抑菌環直徑。

5.流式細胞儀檢測活菌比例:(1)門設定:取1ml菌液，M-H肉湯稀釋成濃度為0.5麥氏單位的菌液(菌液濃度為1.5×108CFU/ml)，再用MH肉湯稀釋20倍，菌液終濃度為7.5×106CFU/ml;取2ml菌液4℃離心4000r/min×2min，加入等體積70%乙醇，重懸菌體;處理10min，4℃離心4000r/min×2min，收集死菌，等體積 PBS重懸;取 2ml菌液，4℃離心4000r/min×2min，收集活菌，等體積PBS重懸;根據死菌及活菌按1∶0、1∶1、0∶1 比例，混合染色后流式細胞儀檢測，采集104個菌細胞，在設計的測定方案中，以前散射光/側散射光(FS/SS)直方圖橫坐標和縱坐標為對數值，調節FS/SS電壓，在此圖中尋找細菌最集中的區域，設門并對門設置的正確性進行驗證，保存數據。(2)各藥物濃度下活菌比例檢測:參照文獻[7，8]，取適量菌液，新鮮MH肉湯調整菌液濃度為0.5麥氏單位的菌液(菌液濃度為1.5×108CFU/ml);加入莫西沙星注射液，使藥物終濃度分別為 64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25 和0.125μg/ml，菌液終濃度為 7.5 × 106CFU/ml，37℃孵育3h;4℃離心4000r/min×2min，收集菌體，PBS重懸菌體，參照試劑說明書，分別加入SYTO-9和PI染液，使其終濃度為分別為1.67和30μmol/L，標記后混勻，4℃共同避光孵育15min，流式細胞儀上機檢測，同時做陽性對照(乙醇殺死菌懸液)、陰性對照(不加藥的菌懸液)，測定各藥物濃度下活菌比例。

6.統計學方法:采用SPSS 17.0統計軟件進行數據分析，數據用均數±標準差()表示，多個樣本的比較采用方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1.最低抑菌濃度:各時相點實驗組和對照組莫西沙星對銅綠假單胞菌ATCC 27853的最低抑菌濃度均為 0.25μg/ml。

2.抑菌環直徑:結果表明，實驗組莫西沙星對銅綠假單胞菌ATCC 27853的抑菌環直徑均大于對照組，1、7、14天實驗組與對照組抑菌環直徑比值分別1.08±0.01、1.12±0.01和1.16±0.01，各時相點差異均有統計學意義(P＜0.05)。隨模擬微重力時相延長，與對照組相比，實驗組抑菌環直徑逐漸延長(P＜0.05)。

3.門設定及死活菌檢測結果:銅綠假單胞菌ATCC 27853 死菌及活菌按 1∶0、1∶1、0∶1 比例，混合染色后流式細胞儀檢測，門設定和直方圖結果見圖2。

4.各藥物濃度下活菌比例:實驗組各藥物濃度下活菌比例均小于對照組，且同一藥物濃度下，實驗組活菌比例與模擬微重力時相呈負相關趨勢(P＜0.05，圖 3)。

討 論

圖2 流式細胞儀藥敏實驗門設定及死活菌直方圖

近年來，對微重力環境下致病菌的抗生素敏感度變化日益受到關注[9]。銅綠假單胞菌是人體常見的條件致病菌之一，是一種致病力較低但抗藥性強的革蘭陰性桿菌。值得重視的是，在“和平號”空間站和國際空間站上均分離到銅綠假單胞菌等多種細菌[3，10]。

RCCS是研究模擬微重力環境下微生物性狀變化的一種主要方法。該系統是培養貼壁和懸浮細胞的裝置，是一種繞水平軸旋轉、充滿液體、通過氣液兩相膜進行氣體交換的圓柱形旋轉壁式生物反應器，其培養室旋轉帶動容器內培養液和培養物一起做旋轉運動，通過調整旋轉速度可實現培養液和培養物與容器壁同步旋轉。培養物在水平軸上建立了近似均質液體的懸浮軌道，重力向量持續隨機分布，使培養物維持在連續的自由落體狀態，作用于細胞的表觀重力下降，從而在地面上模擬了實驗所需的類似太空的微重力環境，同時在垂直軸上則可以創造重力環境[11]。

圖3 各時相點不同濃度莫西沙星作用下活菌比例比值

本實驗研究發現，莫西沙星對經過RCCS模擬微重力環境處理過的銅綠假單胞菌的抑菌環直徑明顯延長，且相同濃度莫西沙星作用下的活菌比例均小于對照組，即14天RCCS模擬微重力能增加銅綠假單胞菌對莫西沙星的敏感度。分析其機制，可能與RCCS模擬微重力環境下銅綠假單胞菌桿菌在分子水平及基因水平上應激反應蛋白變化和致病因子表達等有關[2，4，5]。尹煥才等[12]研究發現經回轉器處理的大腸桿菌出現抗生素敏感突變株，認為G-菌對微重力環境更加敏感。另有研究表明，模擬微重力條件可促進大腸桿菌細胞壁增殖，增強其對氯霉素和青霉素以及高滲透壓和乙醇的抵抗能力[13]。模擬微重力條件下鹽古菌對枯草桿菌肽、紅霉素、利福平的抗藥性亦明顯增加，還有研究人員則報道了不同的研究結果[14]。謝瓊等進行的微生物宇宙飛船搭載試驗顯示，微生物經搭載后的耐藥性遺傳指標基本穩定，產超廣譜酶的大腸桿菌和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌，對頭孢他啶、氧氟沙星、哌拉西林等35種抗生素的耐藥性沒有變化，蠟樣芽胞桿菌對頭孢唑林、頭孢曲松、頭孢噻肟、哌拉西林的耐藥性有所減弱，但對多數藥物的耐藥性不變。顯然，不同微生物在微重力環境下的生物學特性演變和藥物敏感度變化有可能完全不同，其特點及機制有待進一步研究。

本研究還發現，14天 RCCS模擬微重力環境下莫西沙星對銅綠假單胞菌桿菌的抑菌環直徑和相同藥物濃度下活菌比例與模擬微重力時相呈負相關趨勢，即隨RCCS模擬微重力時相延長，銅綠假單胞菌對莫西沙星的敏感度進一步增強。另外發現，最低抑菌濃度卻沒有明顯變化。尹煥才等[12]研究發現經回轉器處理的大腸桿菌抗生素敏感突變株的數量與處理時間呈正相關，微重力環境下連續培養30天后頭孢他定敏感度增強株的突變率為0.5%，培養60天后突變率增至55%，而120天達到了65%。Searles等[15]研究低剪切微重力環境下白色念珠菌的生長變化，發現隨微重力暴露時間的延長，菌株繁殖增快，結構變異，C白菌毒力增強，對兩性霉素B的耐藥性增大，分析認為其歸因于白色念珠菌毒力相關表型對微重力環境的迅速適應。本研究結果與前者接近。最低抑菌濃度是傳統的抗生素敏感度試驗檢測項目，通常需要菌液和抗生素共同孵育16～24h，在此過程中，模擬微重力環境下形成的耐藥性有可能發生作用，這可能是本實驗研究中未能檢測到最低抑菌濃度變化的主要原因[7]。無論由于微重力環境下微生物的抗生素敏感突變株形成，還是因為微生物對微重力環境產生適應和耐受，這種截然相反的表現結果進一步說明了微重力環境下微生物變化/變異以及抗生素敏感度的多樣性和復雜性。

我國即將開展空間站長期太空飛行，研究太空失重或模擬失重對微生物抗生素敏感度影響及其作用機制，不僅為闡明微生物與人類之間的相互作用以及航天任務中航天員感染治療等一系列科學問題提供理論依據，而且還對空間微生物安全監控等都具有普遍的指導意義。

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