Tuftsin衍生物TP影響腫瘤相關巨噬細胞 M IP-1α分子表達

安映紅，賈 娜，李琳娜，韓 蘇，楊德宣，袁守軍

（1.空軍總醫院臨床檢驗中心生化室，北京 100142；2.軍事醫學科學院放射與輻射醫學研究所藥理毒理，北京 100850）；3.南開大學藥學院，天津 300071）

Tuftsin是機體脾臟產生的一段生理活性肽［1］，由蘇-賴-脯-精氨酸（Thr-Kys-Pro-Arg，TKPR）組成的一級結構，具有促吞噬活性，所以命名為促吞噬肽［2］。早期研究表明，Tuftsin具有一定的抗腫瘤活性［3］。然而，由于其較短的肽鏈及體內半衰期使得其至今難以成藥并應用于臨床。T肽（T peptide，TP）是本課題組和制藥公司共同研發的創新抗癌藥［4-5］，結構為由賴氨酸將4個Tuftsin樣結構連接在一起組成。藥物代謝動力學研究表明，TP具有較長的體內半衰期［5］。前期藥效評價結果證明，TP對術后殘瘤具有明顯的抗癌活性［6-8］。對TP作用機制的研究有助于深刻理解TP的術后抗癌過程。腫瘤間質中浸潤的巨噬細胞即腫瘤相關巨噬細胞（tumor associated macrophages，TAMs）是腫瘤組織中浸潤的一群重要免疫細胞，在腫瘤微環境的調控下TAMs可以轉換表型，演變為抑制腫瘤生長的M1型和促進腫瘤進程的M2型［9-10］。前期研究已經證實TP能刺激巨噬細胞并轉化其在腫瘤微環境中的細胞表型發揮抗癌作用。巨噬細胞分泌產生巨噬細胞炎性蛋白-1α（macrophage inflammatory protein，MIP-1α），MIP-1α又名 CCL3，是趨化因子配體 3，參與炎癥及吞噬細胞的活化、趨化，參與組織修復，腫瘤組織中常能檢測到其表達增加。有文獻報道［11］，MIP-1α可促進瘤細胞生長，增值，存活，在人軟骨肉瘤中MIP-1α在刺激劑的作用下還可誘導細胞遷移［12］，是抗腫瘤研究的一個重要靶點。因此，TP既然能通過巨噬細胞發揮抗癌活性，那么也有可能對MIP-1α有調節作用，本研究旨在探討MIP-1α是否是TP抗癌過程中的一個重要靶點，從而為TP抗癌作用機制提供新的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料 昆明小鼠，♀，4～6周齡，體質量18～22 g，購于軍事醫學科學院動物中心，并在軍事醫學科學院動物中心飼養，小鼠食用專用飼料，自由飲水，每日光照12 h，實驗室溫度保持在25℃左右，相對濕度約40%-70%。小鼠巨噬細胞Ana-1細胞株由本實驗研究室傳代保存。TP為白色凍干粉末，純度＞98%，由北京中天康泰生物科技有限公司提供，使用前生理鹽水稀釋。抗小鼠MIP-1α單克隆抗體購自武漢博士德公司。反轉錄（RT）反應試劑盒購買于美國Promega公司。Ⅳ型膠原酶購于美國 In-vitrogen公司，透明質酸酶，DNA酶Ⅰ購于華美生物工程有限公司。配制消化液：1 g·L-1Ⅳ型膠原酶，1%透明質酸酶和0.25%DNA酶Ⅰ。

1．2 TAM s細胞分離 建立小鼠S180術后殘瘤模型，待腫瘤生長至500～800 mm3時，無菌分離新鮮殘瘤組織，生理鹽水清洗3～5次，剪成1～3 mm3的小塊。37℃用消化液消化腫瘤組織塊3 h，制備成單細胞懸液，PBS洗滌2～3次，接種到培養皿中，置于37℃，5%CO2培養箱2 h。然后將未貼壁細胞棄掉，PBS洗滌2～3次，貼壁細胞即為腫瘤相關巨噬細胞［14］。

1．3 RT-PCR實驗 收集Ana-1、TAM或不同濃度TP處理的Ana-1或TAM約500萬個細胞，提取細胞總RNA，測定RNA含量和純度。20μl的反轉錄體系為：1μg RNA加1μl OligodT，配相應體積的無RNA酶水，70℃變性5 min后置于4℃，然后加入5×Prime Buffer 4μl，MgCl22.4μl，dNTP（2.5 mmol·L-1）4μl，Rnasin（20U）0.5μl，RTase 1μl，3.1μl無RNA酶水。反轉錄條件：37℃反應15 min，85℃加熱5min滅活反轉錄酶，然后置于4℃。反轉錄的cDNA產物進行PCR反應，反應條件為：94℃變性5 min；然后經94℃變性30 s，55℃退火30秒，72℃延伸1min，進行30個循環，再72℃延伸5min。1%瓊脂糖電泳檢測PCR產物。引物序列由美國Invitrogen公司合成。β-actin上、下游引物序列為5′-TCTACAATGAGCTGCGTGTG-3′和 5′-GGTCAGGATCTTCATGAGGT-3′；MIP-1α上、下游引物序列為 5′-TCACCTGCTCAACATCATG-3′和 5′-TCAGGCATTC AGTTCCAGCT-3′。

1.4 小鼠異種移植瘤雙瘤手術模型的建立 在小鼠左、右腋下均接種小鼠腹腔抽取的S180肉瘤腫瘤細胞，待小鼠皮下腫瘤生長至約250 mm3時，將其中一側手術切除部分腫瘤組織，建立術后殘瘤模型［4］，左側腋下腫瘤不作處理。按照殘瘤瘤體積大小分組：對照組，陽性藥環磷酰胺（CTX）組及TP 8 mg·kg-1組，并于術后次日開始給藥，CTX劑量為30 mg·kg-1，給藥1次；TP隔天1次，共給藥4次。實驗結束時分離腫瘤組織。

1．5 免疫組化檢測術后殘瘤組織中M IP-1α的蛋白表達 手術剝離的腫瘤組織，用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋制成病理切片，免疫組化染色檢測MIP-1α的表達。

2 結果

2．1 Ana-1細胞和TAM s的M IP-1α的mRNA表達比較 將對數生長期的Ana-1細胞和原代分離的TAMs提取細胞總RNA，檢測并對比 MIP-1αmRNA的表達差別。實驗結果表明兩種來源的細胞MIP-1αmRNA表達量基本一致，差別沒有統計學意義（P＞0.05），如Fig 1所示。結果提示，無論巨噬細胞系，還是原代的巨噬細胞均能高表達MIP-1α。

Fig 1 mRNA expression of M IP-1αin Ana-1 cells and TAM s

2．2 TP對Ana-1細胞M IP-1αm RNA的影響不同濃度TP處理對數生長期的Ana-1細胞72 h后，提取細胞總 RNA，檢測 MIP-1αmRNA的表達。如Fig 2所示，與空白對照組相比，3個濃度（0.2、2和20μmol·L-1）的 TP對 Ana-1細胞的 MIP-1αmRNA表達無明顯影響，組間差異無統計學意義，P＞0.05。可見TP對建系的巨噬細胞系的MIP-1α的表達無明顯影響。

Fig 2 mRNA expression of M IP-1αin Ana-1 cells treated w ith TP

2．3 TP對TAM s的M IP-1αm RNA的影響 不同濃度TP處理原代分離的TAMs 72 h后，提取細胞總RNA，檢測MIP-1αmRNA的表達。如Fig 3所示，與空白對照組相比，TP明顯降低 TAMs的 MIP-1αmRNA的表達，3個濃度（0.2、2和 20μmol·L-1）與空白組相比差異均有統計學意義，P＜0.01，且呈劑量依賴性。可見對于腫瘤組織中的巨噬細胞，TP有其作用的細胞位點，并能引起巨噬細胞生物學的改變，從而導致一些細胞因子表達發生變化。

Fig 3 m RNA expression of M IP-1αin TAM s treated w ith TP**P＜0.01 vs Control.

2．4 TP對腫瘤組織中M IP-1α蛋白的表達影響為進一步證實上述結果，本研究進行了體內試驗以驗證TP是否影響MIP-1α蛋白的表達。首先方法中所描述的建立小鼠S180肉瘤細胞雙瘤模型，并于腫瘤體積生長至約250 mm3時，在其中一側建立術后殘瘤模型后，然后給予CTX和TP。實驗結束時手術瘤和未手術瘤組織均做免疫組化染色，檢測MIP-1α蛋白在各個組的表達情況。實驗結果如Fig 4，TP處理組的荷瘤小鼠的腫瘤組織MIP-1α與對照組相比表達明顯降低，接近于陽性藥環磷酰胺組；而且對于同一只小鼠的手術后的殘瘤組織與未手術的瘤組織，TP均能降低MIP-1α蛋白的表達。

3 討論

TAMs可被調控成M1或M2表型，M1型巨噬細胞呈現強的抗原呈遞能力，分泌IL-12／23，誘導Ⅰ型免疫應答，產生NO、活性氧等，具有對腫瘤細胞的殺傷能力；M2型巨噬細胞釋放免疫抑制因子，促進腫瘤細胞的增殖，演進以及輔助腫瘤細胞遠端轉移［13］。而腫瘤微環境中浸潤的巨噬細胞大多數為M2型［9］。因而，調控腫瘤微環境中的 TAMs，誘導其成為M1型或者使其不被誘導活化為M2型成為研究者熱衷的課題。前期實驗研究已證實調控巨噬細胞是TP發揮抗癌作用的機制之一，TP可調控TAMs，增強巨噬細胞的吞噬、細胞毒功能，促使TAMs分泌 Th1相關的促炎因子（TNF-α、IL-12、NO、CXCL9、CXCL11等），使其向 M1型極化；還可逆轉M2巨噬細胞的表型，增加Th1相關的炎性細胞因子表達［14］。因此，研究TAMs能更深入理解TP抗癌機制。巨噬細胞可產生MIP-1α，其屬于趨化因子家族，參與細胞黏附和遷移，在腫瘤發展過程中具有重要作用。TP能夠降低腫瘤組織中巨噬細胞MIP-1α的表達，并呈劑量依賴性，說明MIP-1α有可能是TP抗癌作用機制的又一新靶點，更加深入的研究有助于對TP體內抗癌機制的深刻理解。

Fig 4 M IP-1αexpression in tumor tissues

目前，外科手術是實體癌患者的首選治療方式，但是手術只能最大限度的降低腫瘤負荷，完全消除腫瘤細胞的可能性較小［15］，預防手術后腫瘤復發是臨床腫瘤治療的關鍵問題。小鼠術后殘瘤模型正是在此臨床背景下建立的［4］。殘瘤模型不僅減輕了腫瘤負荷，而且打破了腫瘤微環境的平衡［16］，打開了腫瘤深度免疫抑制區，使得免疫藥物、免疫細胞或免疫因子可以突破腫瘤組織的免疫抑制屏障，從而發揮抗腫瘤作用［4］。小鼠的雙瘤模型是在小鼠術后殘瘤模型的基礎上建立的。雙瘤模型既包括了術后殘余腫瘤組織，也包括了未手術瘤組織（相當于模擬了臨床實際中遠端未發覺的微小瘤灶）［4］。利用雙瘤模型可以同時檢測到在同一生物個體中手術過的腫瘤組織和未手術的腫瘤組織的特點。本實驗中使用雙瘤模型對同一只小鼠給予TP進行術后治療，比較未手術瘤和手術瘤的腫瘤組織MIP-1α蛋白的表達情況，能更加全面完整的說明TP對腫瘤組織中MIP-1α的表達影響。

探討藥物藥效的體外試驗，常使用細胞系作為藥物作用的對象，用以初步判定藥物作用的效應、方式、環節等；是體內試驗的前期預測試，可以節約實驗成本，避免不必要的浪費；在藥效學研究中也是慣用的操作流程，尤其是在腫瘤藥效學研究中可以利用現成的腫瘤細胞系去很好的判定一些細胞毒類藥物的藥效。然而建系的細胞系由于反復的多次傳代或者生長環境的改變，細胞本身的一些生物學特點與原代細胞相比可能已發生改變，對于一些刺激細胞活性或作用于細胞膜表面受體的藥物，如本文研究中的Tuftsin或TP，直接作用于細胞系就可能達不到預期的結果。本研究中Ana-1細胞是建系的巨噬細胞系，TAMs是原代巨噬細胞，TP作用于Ana-1細胞并不能影響MIP-1α的表達，而對于TAMs，TP可明顯降低體內、外TAMs的MIP-1αmRNA的表達。這些結果說明對于免疫增強劑TP，單純的體外細胞系試驗并不能反映其在體內發生作用的真實情況，藥效學評價時，體外實驗的陰性研究結果需要慎重對待。TP在動物體內的作用方式、環節較為復雜，涉及很多免疫調控，因此，關于TP抗癌機制還有待進一步探索研究。

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