氧誘導新生小鼠視網膜病變中血管新生和氧應激相關基因表達的變化

余增洋，龔陳媛，張國慶，季莉莉

（1.上海中醫藥大學中藥研究所中藥標準化教育部重點實驗室，中藥新資源與質量標準綜合評價國家中醫藥管理局重點研究室，上海市復方中藥重點實驗室，上海 201203；2.上海兒童醫學中心，上海 200127）

隨著新生兒護理條件的改善，早產兒存活率明顯增加，然而這也導致了較高的早產兒視網膜病變（retinopathy of prematurity，ROP）的發病率。目前，ROP已成為嚴重威脅新生兒視力健康的一種疾病，由Smith等［1］建立的氧誘導新生小鼠視網膜病變模型（oxygen-induced retinopathy，OIR）成功復制了ROP的特點，在ROP研究中得到廣泛應用。

OIR病理機制目前尚未明確，有諸多細胞因子和通路可能都參與其病變過程。目前認為，缺血、缺氧誘導視網膜血管異常增生是導致ROP的根本原因［2-4］。由缺氧誘導因子（hypoxia-inducible factor-1，HIF-1）介導表達的血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是公認的具有明顯促進微血管新生功能的生長因子［5］；血小板衍生生長因子 （platelet-derived growth factor，PDGF）也具有促進微血管新生的功能［6-7］。然而，OIR過程中血管新生相關基因表達的變化缺乏較為系統的研究，同時OIR過程中VEGF及PDGF受體變化的研究相對較少。血管新生過程還涉及血管基底膜和細胞外基質的崩解，已知基質金屬蛋白酶（matrixmetalloproteinases，MMPs）在其中發揮重要作用［8］，本文中我們選取了MMPs的兩個重要成員MMP2和MMP9，分別檢測了其在OIR過程中的基因表達變化。此外，有研究發現缺氧誘導產生的氧化應激也參與ROP的發展過程中，高氧-復氧過程引起視網膜相對缺氧，增加ROS的產生，引起視網膜血管氧化損傷［9-10］。Nrf2是參與調控抵抗氧化應激的主要核轉錄因子。因此本論文在建立的新生小鼠OIR模型基礎上，運用Real-time PCR技術觀察了促血管新生相關的VEGF及其受體、PDGF及其受體，以及在降解細胞外基質起作用的MMP家族相關基因的表達情況；同時還檢測了氧應激相關Nrf2及其調控的GCLC、GCLM基因的表達情況。

1 材料與試劑

1.1 實驗動物 SPF級C57BL小鼠，♀♂各5只，8周齡，購自中國科學院上海實驗動物中心［合格證號：SCXK（滬）2012-0002］。飼養于上海中醫藥大學動物實驗中心，♀♂隨機組合為5對進行繁殖，溫度（22±1）℃，濕度（55±5）%，飼料與水消毒后自由攝取，12 h光暗循環。實驗嚴格按照國家和上海中醫藥大學動物中心動物使用管理條例進行。

1.2 試劑 多聚甲醛、Triton X-100、Gelatin均購自國藥試劑；CD31抗體、FITC conjugated anti-Rat IgG均購自 BD（Franklin Lakes，NJ）；PrimeScript RTMaster Mix Perfect Real Time、SYBR Premix Ex Taq（Tli RNaseH Plus）（TaKaRa）；用于 Real-Time PCR特異性引物序列見Tab 1，購自上海捷瑞公司。

Tab 1 Sequences of primers used for real-time RT-PCR

1.3 儀器 DYC-I型常壓動物實驗艙（中國船舶重工集團公司第七○一研究所）；冷凍層析柜（北京德天佑公司）；水平搖床（基因公司）；解剖顯微鏡、倒置熒光顯微鏡（Olympus）、移液器、渦旋振蕩儀、低溫離心機（Eppendorf）；Real-Time PCR儀（ABIStepone Plus）。

2 方法

2．1 OIR模型建立 C57BL小鼠出生后d 7（P7），隨機分為正常組與缺氧組，每組10只。正常組小鼠飼養于正常氧環境中；缺氧組小鼠飼養于75.5%氧分壓氧艙中，高氧環境5 d后，即d 12返回至正常氧環境中，繼續飼養5 d，至17 d（P17）。

2.2 視網膜免疫熒光鋪片 取P17小鼠處死，摘取眼球，于4%多聚甲醛（in PBS）中4℃固定過夜，于解剖顯微鏡下，用虹膜剪沿角膜邊緣剪開，移除晶狀體和玻璃體，取出完整視網膜，PBS洗2～3次，Blocking Buffer（5%BSA，0.5%Trixton X-100 in PBS）封閉2 h，與 CD31抗體于4℃ 孵育2 d，Wash Buffer（0.5%Trixton X-100 in PBS）洗6次，與二抗避光孵育2 h，Wash Buffer洗6次，剪視網膜成花瓣狀，平鋪于載玻片上，明膠（2 g·ml-1）固定并封片，于熒光顯微鏡下觀察并拍照。

2．3 Real-Time PCR檢測 P17小鼠脫頸椎法處死，摘取眼球，放置于 DEPC-treated Water中，于解剖顯微鏡下取出視網膜組織（若不立即進行后續實驗，樣本組織存放于-80℃）。運用TRIzol試劑（Invitrogen），提取視網膜組織總mRNA，總mRNA溶解于RNase-free H2O中，1μg總 mRNA按照試劑盒（TaKaRa）方法逆轉錄合成cDNA，Real-Time PCR擴增按照試劑盒（TaKaRa）方法，相對基因表達分析采用 2-ΔΔCt法。

2.4 數據分析 數據結果均用表示。實驗數據采用SPASS 16.0軟件統計，兩兩比較采用獨立樣本t檢驗。

3 結果

3.1 視網膜血管免疫熒光鋪片 結果顯示，P17正常組小鼠視網膜血管網以視盤為中心呈放射狀向周圍排列，血管密度分布均勻，走形自然，無血管閉塞（Fig 1 A、C、E）。OIR組小鼠視網膜視盤周圍呈現大量無灌注區（Fig 1B）；在無灌注區沿視網膜放射狀動脈，箭頭指示處可見明顯新生血管芽（Fig 1D）；視網膜周邊區域血管密度明顯增加，血管迂曲、擴張、變形、不規則，并可見微血管瘤（Fig 1F）。

3．2 VEGF及其受體的基因表達情況 結果顯示，與正常組相比，OIR小鼠視網膜組織中 VEGFA、VEGFD的基因表達上調，VEGFB、VEGFC的基因表達未見變化；其相應受體家族中，VEGFR1、VEGFR2的基因表達上調，VEGFR3表達未見變化。見Fig 2。

Fig 1 CD31 immunofluorescence staining of the retinasA：Whole retinas of control，B：Whole retinas of OIR model（4×magnification）；C：The central region in retinas of control；D：The central region in retinas of OIR model.（Arrows indicate the new vessels）（10×magnification）；E：The peripheral region in retinas of control；F：The peripheral region in retinas of OIRmodel（10×magnification）.

Fig 2 Retinal gene expression of VEGFs and VEGFRs in control and OIR m ice*P＜0.05，**P＜0.01 vs control.

3．3 PDGFs及其受體基因表達情況 PDGF是另一個重要的促進血管新生因子家族，我們的結果顯示，與正常組相比，OIR小鼠視網膜組織PDGFA、PDGFB及其受體PDGFRa、PDGFRb的基因表達均呈現上調，尤其是PDGFB上調更為明顯，顯示出PDGFB可能在OIR模型中發揮促進血管新生的重要作用。見Fig 3。

Fig 3 Retinal gene expression of PDGFs and PDGFRs in control and OIR m ic*P＜0．05，**P＜0．01 vs control.

3．4 MMP2與MMP9基因表達情況 MMPs調節細胞外基質降解，以促進血管內皮細胞遷移和新生血管形成。我們的結果顯示，與正常組相比，OIR小鼠視網膜組織MMP2基因表達上調，但MMP9基因表達下調。說明MMP2可能在OIR小鼠視網膜降解血管基底膜，促進內皮細胞遷移和新生血管形成方面起重要作用。見Fig 4。

Fig 4 Retinal gene expression of MMP2 and MMP9 in control and OIR m ice*P＜0．05，**P＜0．01 vs control.

3.5 抗氧化相關基因表達情況 我們檢測了在氧應激中具有重要調控作用的核轉錄因子Nrf2及其所調控的下游基因GCLC和GCLM的表達情況。結果顯示，OIR小鼠視網膜組織中 Nrf2、GCLC及GCLM的基因表達均下調。見Fig 5。

Fig 5 Retinal gene expression of Nrf2，GCLC andGCLM in control and OIR m ice**P＜0．01 vs control.

4 討論

ROP已成為導致嬰兒失明的主要原因，占中等發達國家兒童致盲原因的6%-18%［11］，臨床上尚無理想的治療方法和藥物。我們采用由Smith等［1］所建立的方法，新生小鼠由于視網膜血管床未發育完全，放入高氧環境中血管停止生長，再返回正常氧環境后，相對缺氧狀態誘導視網膜血管異常新生。在本實驗中，我們成功制備了OIR模型，為治療ROP的藥物篩選建立了平臺。并對參與引起微血管新生的一些關鍵信號分子的基因表達情況進行了檢測，這些為我們后期藥物靶向治療及相應藥理研究奠定了前期基礎。

VEGF家族包括 VEGFA、VEGFB、VEGFC、VEGFD；VEGF受體包括 VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3；VEGFs通過與VEGFRs結合發揮作用。VEGFA即一般所指的VEGF，是機體內最重要的促血管生成因子，可與VEGFR1及VEGFR2結合。現在認為，VEGFA主要通過與VEGFR2結合來發揮促血管新生的作用；相反，VEGFR1與VEGFA結合后可抑制VEGFR2對VEGFA的激活作用［12］。VEGFR1的作用可能不是表現在直接促進血管新生，而是通過特異性促進血管組織釋放生長因子，間接促進血管新生［13］。我們的實驗結果發現在OIR模型中視網膜中VEGFA和其受體VEGFR1、VEGFR2的表達均明顯增加，說明它們在ROP病變過程中具有一定的作用。VEGFD是重要的促進淋巴內皮細胞增殖的生長因子，它主要和淋巴管內皮細胞上VEGFR3結合發揮作用［14-15］。我們的實驗結果發現，VEGFD表達有所增加，但是其受體的表達并未見明顯增加，因此VEGFD在ROP中的作用有待進一步深入研究。有研究表明，缺氧刺激下，VEGFB、VEGFC基因表達并未增加［16］，我們的結果印證了這一點。

血小板衍生生長因子家族PDGFs同VEGF有較大同源性，是另一種重要的促血管生成因子［6-7］，主要包括 PDGFA和 PDGFB，其受體是 PDGFRa、PDGFRb。我們的結果顯示，缺氧刺激下，PDGFA、PDGFB、PDGFRa、PDGFRb基因表達均上調，說明PDGFA和PDGFB在ROP病變中起重要作用。

MMPs在調節視網膜血管細胞外基質降解，促進內皮細胞遷移中起重要作用［8］。我們的結果顯示，相對缺氧刺激下，MMP2基因表達上調，而MMP9基因表達下調。體外實驗上，有報道顯示，猴視網膜內皮細胞RF／6A在缺氧刺激下，MMP2基因表達上調，而MMP9基因表達下調，這與我們體內實驗的結果一致［17］。說明缺氧刺激通過上調MMP2而非MMP9表達，進而發揮降解細胞外基質的作用。

已有研究發現氧化應激在缺氧誘導視網膜微血管增殖性病變中起重要作用［9-10］。核轉錄因子Nrf2是細胞防御過氧化應激的重要調節因子。Nrf2結合到基因抗氧化應激反應元件（antioxidant responsive element，ARE）的啟動子序列上，可啟動一系列抗氧化基因的表達，其中主要包括 GCLC，GCLM。我們的結果顯示，與正常組相比，OIR小鼠視網膜組織中Nrf2、GCLC、GCLM的基因表達均下調。說明缺氧刺激下，OIR小鼠視網膜組織抗氧化能力下調，提示氧化應激參與了缺氧誘導小鼠視網膜病變的過程。

綜上所述，正常機制狀態下，視網膜組織內部維持動態的平衡，包括促血管生成與抑制血管生成之間、氧化應激的產生與抵抗氧化應激之間等等。通過我們建立的OIR模型的研究，我們發現當受到外界缺氧刺激，打破了視網膜組織內部這些平衡，就會導致其朝向促進血管新生、降低抵抗氧應激能力的方面發展。

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