以細胞存亡調控蛋白c-FLIP為靶點的癌癥治療研究

陳立立，陳忠明，王冠林，張寬仁

（昆明理工大學生命科學與技術學院，云南昆明 650500）

目前，癌癥已經成為危害人類生命健康的最大殺手。癌癥主要是控制細胞分裂增殖機制失常而引起的疾病，除此之外，還會局部侵入正常組織甚至經由體內循環系統或淋巴系統轉移到身體其它部分。

腫瘤壞死因子相關的死亡誘導配體 （TNF-related apoptosis inducing ligand，TRAIL）是新發現的腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）超家族成員，與其它成員不同，它能選擇性誘導轉化細胞、腫瘤細胞和病毒感染細胞發生凋亡，而對正常細胞沒有明顯的毒害作用［1］。因此，自TRAIL發現以來，其誘導癌細胞凋亡的分子機制一直是研究的重點和熱點，利用其誘導的凋亡效應殺死腫瘤細胞具有廣闊的臨床應用前景。

然而，近年來研究發現，很多腫瘤細胞對TRAIL產生了耐受，其中一個很重要的原因是腫瘤細胞通過合成抗凋亡蛋白，如凋亡抑制蛋白 （inhibitor of apoptosis，IAP）、（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）家族的抗凋亡蛋白、細胞型Fas相關死亡域樣白介素-1β轉換酶抑制蛋白 （cellular FADD-like IL-1β-converting enzyme-inhibitory protein，c-FLIP）等，從而對凋亡產生耐受，這是腫瘤抗凋亡的重要調節機制。

c-FLIP是一種抗凋亡蛋白，在許多惡性腫瘤細胞中都過量表達，這使得腫瘤細胞擁有了一定的逃生機制［2］。因此，通過靶向治療來修復腫瘤細胞對凋亡的敏感性，對研究化學治療產生的藥物耐受性具有重要作用。

目前，針對抗凋亡蛋白IAP、Bcl-2為靶點的抑制劑有很多，多數已進入臨床Ⅰ期、Ⅱ期實驗［3-4］。但是，以c-FLIP為靶點的研發藥物報道很少，除了RNA干擾的方法外，尚無c-FLIP專一性抑制劑或拮抗劑的報道。本文主要對以c-FLIP為靶點的癌癥治療的化學藥物、方法進行綜述，探討降低、抑制或拮抗c-FLIP的方法，并提出新的思路，從而尋找一個潛在的安全的治療癌癥的方法，這對腫瘤的臨床治療具有重要意義。

1 細胞凋亡的信號通路

在癌癥發生過程中，抑制和抗凋亡作用是癌細胞永生化的必要手段。目前，細胞凋亡信號轉導通路主要包括外源途徑和內源途徑。

外源途徑，又稱死亡受體凋亡途徑。TRAIL作為死亡受體信號通路中一個關鍵配體，與DR4（death receptor 4）或DR5結合后導致受體三聚化，細胞內包含死亡結構域（death domain，DD）的蛋白分子聚集成簇并募集接頭蛋白（Fas associated death domain，FADD）。FADD的DD結構域負責和DR4或DR5分子胞內的DD結構域結合，N-端的DED則結合procaspase-8的 DED，并使其進行寡聚化，TRAIL-DR4／DR5-FADD-procaspase-8以串聯形式組合形成死亡誘導信號復合物 （death-inducing signaling complex，DISC）。其中procaspase-8發生自身裂解，成熟并釋放其活性亞單位caspase-8，直接激活下游效應因子caspase-3、caspase-6和caspase-7。最終使得細胞出現一系列凋亡現象，如Fig 1所示。

內源途徑，又稱線粒體凋亡途徑。當procaspase-8激活不充分時，主要是通過線粒體途徑來執行凋亡。通過Bcl-2家族中只含BH3同源區的Bid的切割來誘發凋亡。caspase-8／10或粒酶B（granzyme B）可以直接切割底物Bid，產生tBid，再進一步促進Bax和Bak作用線粒體膜，使細胞色素C（cytochrome C，cyt-C）從線粒體中釋放。釋放到細胞質的cyt-C在dATP存在的條件下能與凋亡相關因子-1（apaf-1）結合，使其形成多聚體，并促使procaspase-9與其結合而形成凋亡小體（apoptosome）。procaspase-9在凋亡小體上自切割活化，導致caspase-3的大量活化及隨后的凋亡，如Fig 1所示。

2 細胞存亡調控蛋白c-FLIP

2.1 c-FLIP的結構 c-FLIP最初是在研究病毒時被發現的。Thome等［5］發現某些病毒，例如人的皰疹病毒（8HHV8）、人疣痘病毒等，寄生細胞后，會使細胞逃避機體的免疫監視，并且發現凋亡的細胞明顯少于正常細胞。1997年，Irmler等［6］發現一些病毒 （如 γ-皰疹病毒、痘病毒等）含有一種可抑制細胞凋亡的基因，通過這種基因表達的蛋白能保護受感染的細胞不發生凋亡，從而使得病毒得以存活，繼續復制。這種蛋白在結構上與 FLICE（FADD-like IL-1βconverting enzyme／caspase-8）相似，而且能抑制FLICE的作用，故被命名為FLIP，因其來源于病毒，所以又稱為v-FLIP。目前，已有6個同族亞型的v-FLIP被證實。再后來，人們又分離得到 v-FLIP的人類細胞類似物 （cellular-FLIP，c-FLIP）。人類c-FLIP基因含13個外顯子，與procaspase-8／10基因均位于染色體的2q33-34位置，兩者相距大概200bp［7］。

c-FLIP又稱 Casper、iFLICE、FLAME-1、CASH、CLARP、MRIT等，因其與細胞的死亡、存活信號密切相關，所以又稱之為細胞存亡調控蛋白。雖然c-FLIP在mRNA水平上存在13種不同切割亞型，但是，到目前為止，在人類細胞的蛋白水平上，只能檢測到3種表達形式：c-FLIPL（55 ku）、c-FLIPS（26 ku）、c-FLIPR（24 ku）［7］。

c-FLIPL和c-FLIPS通過選擇性切割，可以產生不同的變體。外顯子7會使得c-FLIPS／R的翻譯終止，而c-FLIPL則可跳過外顯子7，這也是它最長的原因。c-FLIPR的mRNA缺失了內含子6的切割能力，導致內含子6的起始部分的開放閱讀框中出現終止密碼，最終使得c-FLIPR成為3種亞型中最短的一種。而與人類相比，老鼠中只存在兩種亞型即c-FLIP和c-FLIP［8］。LR

c-FLIPL含有一個與procaspase-8相似的結構域，即N端含有兩個相互串聯的DED，C端含有一個與caspase同源的結構域，但由于起催化作用的兩個氨基酸殘基Cys、His分別被Tyr、Arg所取代，因此，不具備了caspase蛋白水解酶的活性，從而不能形成活化的片段。c-FLIPS和v-FLIP很相似，除了具有兩個DED外，在C端尾巴上還有一個19個氨基酸的特殊片段，這個片段是進行泛素化、蛋白酶體降解的關鍵調控位點。c-FLIPR的N端也含有DED，但與c-FLIPS相比，其C端則缺少了這些氨基酸片段的延伸［9］。

Fig 1 TRAIL mediated cell apoptosis and survival signaling pathways

2.2 c-FLIP的作用 動物模型實驗研究結果顯示，c-FLIP在T細胞增殖和胚胎發育中起著重要的作用。在研究不同癌癥時，如結腸癌、胃癌、胰腺癌、黑色素瘤、B細胞慢性淋巴細胞瘤、卵巢癌等，都發現有c-FLIP的異常表達［10］。c-FLIP也因此被認為是癌細胞發生免疫逃逸的決定性因子之一。c-FLIP主要參與TRAIL、Fas、TNF-α介導的凋亡途徑，并且是人類惡性腫瘤對化療藥物產生耐藥性的主要原因。然而，c-FLIP調節凋亡的具體機制，到目前為止仍不是很清楚。

廖：那時沒有人高喊“科普”口號，但有科普之實；現在喊口號、吃科普飯的人越來越多，但盛名之下，其實、其質又如何呢？這才是最值得我們思考的問題！

人源c-FLIP的不同亞型扮演著不同的調節作用。c-FLIPL／S與 procaspase-8都能結合到 FADD，形成不同 DISC，但由于c-FLIPS無蛋白水解酶的活性片段或類似片段，使得procaspase-8的二聚化及下游的活化受到抑制，最終阻止凋亡級聯反應的發生。Kim等［11］研究c-FLIP阻止細胞凋亡的機制時，發現c-FLIPS可能通過維持抗凋亡蛋白 XIAP的表達水平以及激活 Akt途徑來抑制奧沙利鉑 （oxaliplatin）誘導的凋亡作用。

但c-FLIPL與procaspase-8能形成異源二聚體，c-FLIPL含有無活性但類似于procaspase-8的蛋白水解酶的活性片段，此異源二聚體的蛋白水解酶活性受到限制，最終只能產生p43／p41-p43-c-FLIP異源二聚體。p43-c-FLIP則有促進細胞增殖及介導細胞存活的作用 （Fig 1）。在研究 c-FLIP缺失的小鼠時，Chang等［12］發現，c-FLIPL具有雙重功能，除了能競爭結合procaspase-8，具有抗凋亡的能力外，還能有限地激活procaspase-8，具有促凋亡的作用。然而，c-FLIPL抗凋亡和促凋亡的作用，主要是通過c-FLIPL在細胞中的表達水平來決定。在許多細胞中發現，當c-FLIPL的表達水平較低時，具有促進procaspase-8活化的作用，而在一些細胞 （如單核細胞、巨噬細胞和某些腫瘤細胞）中，當 c-FLIPL表達水平為中等時，便成為procaspase-8活化的抑制劑。而當c-FLIPL通過瞬時表達達到一個非常高的非生理濃度時，c-FLIPL僅依靠自身的細胞毒性作用就能抑制caspase-8的活性，而不需要TRAIL的介導。雖然c-FLIPL在procaspase-8的活化方面扮演著雙重角色，但至少在腫瘤細胞的生理表達水平范圍內，它仍然扮演一個非常重要的凋亡抑制蛋白的角色。

Tab 1 Medicine or compounds inhibiting c-FLIP expression at the transcriptional level

3 c-FLIP為多種腫瘤化療藥的靶點之一

由于細胞存亡調控蛋白c-FLIP在很多腫瘤細胞中存在，并且在這些腫瘤細胞中起著很重要的抗凋亡的作用，所以，在近年來新研究的抗腫瘤藥物中，以c-FLIP為靶點的藥物研發也越來越多，如下調c-FLIP的轉錄、翻譯水平，或是促進它的降解等。

3.1 轉錄及翻譯調節（Tab 1、2） 目前，治療DNA損傷的藥物有望下調c-FLIP的水平。一些化學治療藥物包括順鉑（cisplatin）［13－14］、阿霉素 （doxorubicin）［15］、拓撲異構酶 I（topoisomerase I）的抑制劑［16］等在不同腫瘤細胞中通過抑制c-FLIP的轉錄，促進癌細胞對死亡受體引起的凋亡的發生。組蛋白脫乙酰酶抑制劑 （histone deacetylase inhibitors）通過下調c-FLIP的轉錄、翻譯水平，成功地抑制了不同惡性腫瘤細胞的增殖，并使其發生凋亡［17－19］。例如，最近，Bijangi-Vishehsaraei等［17］發現的一種新的組蛋白脫乙酰酶抑制劑［4-（4-Chloro-2-methyphenoxy）-N-hydroxybutanamide，CMH］，通過下調c-FLIPL和 c-FLIPS的mRNA和蛋白水平，使得人乳腺癌細胞MCF-7發生凋亡。更有趣的是，這種藥物會使得對阿霉素具有抗性的突變的MCF-7細胞具有更強的凋亡作用。

Kinoshita等［20］在研究人成骨肉瘤細胞MG-63通過免疫調節機制逃離Fas／CD95介導的凋亡時發現，當使用順鉑后，發現它對凋亡的敏感性增強，進一步研究后，發現順鉑主要是下調c-FLIPL，而對其它的抗凋亡蛋白如XIAP等沒作用。

組蛋白去乙酰化酶和拓撲異構酶I的抑制劑也被作為調節c-FLIP水平的新的抗腫瘤藥。Park等［21］在卵巢癌細胞SKOV3中發現，曲古抑菌素A（trichostatin A）可以下調c-FLIPL的mRNA和蛋白水平，而對c-FLIPS無明顯影響。與此同時還發現，表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）信號途徑的抑制劑會阻礙通過曲古抑菌素A調控的c-FLIPL的下調作用。

Jani等［22］在研究結腸癌細胞時，發現多種結腸癌細胞都對TRAIL或奧沙利鉑產生了耐藥性，究其原因，在這些腫瘤細胞中抗凋亡蛋白c-FLIP和 Mcl-1（myeloid cell leukemia-1，Bcl-2家族的一個新成員）的表達都有所上升，導致NF-κB上調，最終導致腫瘤細胞具有了抵抗凋亡的能力，但實驗發現，結腸癌細胞在經過NF-κB的抑制劑奎納克林 （quinacrine）或是 Iκκ（inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase，Iκκ）抑制劑BMS-345541處理后，細胞對凋亡的敏感性大大增加，使得細胞恢復了凋亡活性。Charette等［26］發現，salirasib處理肝癌細胞后，下調了Ras的表達，而且還能抑制哺乳動物雷帕霉素靶蛋白 （mammalian target of rapamycin，mTOR）的表達，使得與凋亡相關的caspase-3被激活、細胞色素C釋放、死亡受體上調，以及細胞存亡調控蛋白c-FLIP在mRNA水平上的表達降低，最終使得肝癌細胞發生凋亡。

Katz等［31］發現，使用多激酶抑制劑索拉非尼 （sorafenib）對治療惡性胸膜間皮瘤具有很好的療效，在索拉非尼作用3 h后，很多抗凋亡蛋白，包括Mcl-1、c-FLIPL、生存素以及cIAP等發生磷酸化或是表達水平降低，從而增強了惡性胸膜間皮瘤對TRAIL的敏感性。

Olsson等［36］用濃度 300μg·L－1TRAIL處理慢性 B淋巴細胞白血病 （B-cell chronic lymphocytic leukemia，B-CLL）后，發現細胞仍然耐受，但當加入RNA的合成抑制劑放線菌素D（actinomycin D）后發現，B-CLL細胞對TRAIL誘導的凋亡開始敏感。最終通過蛋白質印跡等實驗，證明了細胞對TRAIL產生耐受的根本原因在于c-FLIPL的過高表達，而放線菌素D的作用則是使得c-FLIPL和c-FLIPS的表達都降低。

Day等［2］發現，在低濃度的紫杉醇 （taxol）作用下，會引起CCRF-HSB-2人急性淋巴母細胞型白血病細胞發生caspase-8／10依賴的凋亡，而且會引起c-FLIPS和c-FLIPL下調。另外，紫杉醇會通過轉錄后調控和非caspase依賴機制來降低c-FLIP的表達。

Tab 2 Medicine or compounds inhiniting c-FLIP expression at the post-transcriptional level

3.2 干擾RNA的方法：siRNA RNA干擾 （RNA interference，RNAi）是一種廣泛存在于高等植物和動物中的由雙鏈RNA介導的轉錄后基因沉寂 （post transcriptional gene silencing，PTGS）的現象。外源雙鏈RNA在細胞內一種被稱為Dicer的核酸酶的作用下，被剪切成含19-23個核苷酸對的小RNA片段，稱為小干擾 RNA（small interfering RNA，siRNA）。后者與Dicer及其它一些蛋白質共同構成RNA誘導的沉寂復合物 （RNAi inducing silence complex，RISC），依靠堿基互補規律識別與siRNA同源的mRNA分子，并將其降解。在腫瘤的基因治療過程中，通過人工合成特定癌基因靶向的siRNA，并將其導入腫瘤細胞中，可以特異性地抑制目的基因的表達。干擾RNA的方法可以直接抑制c-FLIP蛋白的翻譯過程，使得 c-FLIP的表達量降低。Chawla-Sarkar等［37］通過siRNA技術成功地下調了抗凋亡蛋白Bcl-2、FLIP和IAPs的表達。

在體外，以c-FLIP基因為靶點的siRNA技術改變了傳統的癌癥治療方法。Day等［38］發現在很多腫瘤細胞中，c-FLIPsiRNA的脂質體復合物，能夠成功干擾c-FLIP基因，使得體外的MCF-7細胞發生自發性的凋亡，而且注射c-FLIP siRNA的脂質體復合物到小鼠的MCF-7移植瘤中，移植瘤也出現了自發性凋亡。

除此之外，非小細胞肺癌細胞 A549、結腸癌細胞HCT116等的c-FLIP基因的表達都會因此降低。但是，在體內siRNA卻仍有很多局限性，臨床上要將siRNA用來治療腫瘤，可能還需要一段時間。

3.3 c-FLIP的降解（Tab 3） c-FLIP抑制劑或拮抗劑主要是通過泛素化-蛋白酶系統來實現對c-FLIP的降解。廣譜的代謝抑制劑是最早被用來研究抑制c-FLIP表達的機制。目前，許多化合物都對細胞中的c-FLIP有廣泛的下調作用，如蛋白合成抑制劑環十二碳三烯 （cyclohexamide）或者茴香霉素 （anisomycin）［39］。化學治療藥5-氟尿嘧啶 （5-FU）也被證實能下調癌細胞系的c-FLIPL和c-FLIPS［40］。蛋白酶抑制劑硼替佐米（bortezomib）被廣泛應用于許多不同的細胞系。何杰金病細胞、星形細胞瘤細胞、鼻腔神經膠質瘤細胞、髓系白血病細胞、骨髓瘤細胞等，在經過硼替佐米處理過后，c-FLIP的水平都有所下降。然而，Zhao等［41］則發現，硼替佐米主要作用的是c-FLIPL，但也有作用于c-FLIPS的，c-FLIPL的下調和c-FLIPS的上調好像有關。在研究小分子的蛋白酶抑制劑MG-132時發現，它在不同的細胞系中對c-FLIP都有下調、抑制的作用。MG-132、PS-34在慢性淋巴細胞性白血病細胞中，能夠上調TRAIL和它的死亡受體DR4、DR5的表達量，最終下調了c-FLIP的表達。很明顯，硼替佐米和MG-132促進每種細胞對TRAIL誘導凋亡的敏感性，這表明凋亡的恢復并不是c-FLIPL和c-FLIPS同時下調的結果。但是，要真正解釋c-FLIP的亞型的作用，還需要進一步的研究。

3.4 死亡配體與傳統化學治療藥物聯合用藥 研究發現，單純降低c-FLIP的蛋白或RNA水平，不能明顯促進腫瘤細胞的凋亡。所以，在降低抗凋亡蛋白的表達的同時，還必須同時激活外源性凋亡機制，而激活外源性凋亡機制則與死亡配體 TRAIL、FasL或 TNF-α等有關 （如 Tab 1、2、3）。

但是，一直以來，死亡受體及其配體都被認為會引起細胞毒性的級聯反應，不光對腫瘤細胞，對正常細胞也會有一定的毒害作用。而且，研究還發現，死亡配體和受體具有許多非凋亡相關的功能，包括調節細胞增殖、分化、細胞趨化因子的產生、炎癥反應以及促進腫瘤細胞生長的功能，如TNF-α引起的炎癥反應導致的腫瘤生長［45］、Fas及其配體會介導具有免疫功能的正常淋巴細胞發生凋亡等［46］。

然而，近年來發現的死亡配體TRAIL只對腫瘤細胞具有作用，而對正常細胞幾乎沒有影響，因此，被認為是一種很好的抗癌藥。但是，Naka等［47］在研究具有嚴重聯合免疫缺陷的小鼠時發現，當其被移植了結腸腫瘤時，TRAIL單獨用藥時抗腫瘤效果不是很明顯，但是，如果將TRAIL與傳統的化療藥物，如5-FU或伊立替康聯合用藥時，具有很明顯的抗腫瘤效果。所以，將TRAIL與傳統的化學治療藥物聯合用藥，能增加TRAIL對腫瘤細胞的敏感性，這樣可以協同提高對腫瘤的治療效果。

Tab 3 Medicine or compounds inducing c-FLIP degradation

4 結語與展望

c-FLIP不同亞型在不同癌細胞中是否具有不同的作用，其具體的作用機制目前仍不清楚。雖然已經發現藥物對其具有抑制作用，但通常不是對c-FLIP各種亞型都有作用，而只是針對c-FLIP的某一種亞型有作用。

作為死亡受體凋亡途徑中一個關鍵的負調控因子，c-FLIP是腫瘤治療的一個非常關鍵的作用靶點。雖然很多化學治療藥物對c-FLIP都具有一定的下調作用，但是，到目前為止，除了siRNA的方法，無論是在mRNA水平，還是在蛋白水平，還沒有一個直接只作用于c-FLIP的小分子抑制劑。這也使得研究小分子的c-FLIP專一抑制劑或拮抗劑具有重要的意義。

因為c-FLIP與procaspase-8相比，起催化作用的兩個氨基酸殘基被取代，因此，不具備caspase蛋白水解酶的活性，從而不能形成活化的片段，使其沒有酶切活性。又由于 v-FLIP家族中MC159的晶體結構已被解析出來，c-FLIP與procaspase-8的DED區域通過氨基酸序列比對，可以看出二者的DED區域具有明顯的差異，這說明兩者與FADD的DED結合位點可能有很大的差異。最近，Majkut等［48］發現，c-FLIP與 FADD結合于 FADD的 DED的 α1-螺旋和 α4-螺旋，procaspase-8與FADD結合于FADD的DED的α2-螺旋和α5-螺旋。根據這一特性，可以尋找一些能夠干擾c-FLIP的DED募集到FADD的小分子化合物，而且這些化合物不會抑制procaspase-8的活化。目前，可以通過建立高通量或高內涵篩選體系，有望從眾多的化合物中篩選出c-FLIP的專一性拮抗劑。

但是，在尋找降低c-FLIP表達的藥物過程中，發現很多藥物或化合物在殺死腫瘤細胞的同時，對正常細胞同樣會造成損傷。比如楝酰胺（rocaglamide），雖然它能夠明顯降低c-FLIP的表達，但是，實驗中發現，它對正常細胞也有很大的毒害作用，正因為如此，其沒有被廣泛應用。傳統化學治療藥物對正常細胞也有類似毒害作用，這使得將來的研究方向更加明確，需要找到一種只針對于腫瘤細胞有作用，而對正常細胞沒有傷害的靶向特異性藥物。

總之，以細胞存亡調控蛋白c-FLIP為靶點篩選出它的專一性抑制劑，并激活外源性凋亡通路，將為癌癥治療提供新的方法與思路，對腫瘤的臨床治療具有重要的指導意義。

參考文獻：

［1］ Almasan A，Ashkenazi A.Apo2L／TRAIL：apoptosis signaling，biology，and potential for cancer therapy［J］.Cytokine Growth Factor Rev，2003，14（3－4）：337－48.

［2］ Day T W，Najafi F，Wu C H，Safa A R.Cellular FLICE-like inhibitory protein（c-FLIP）：a novel target for Taxol-induced apoptosis［J］.Biochem Pharmacol，2006，71（11）：1551－61.

［3］ Laukens B，Jennewein C，Schenk B，et al.Smac mimetic bypasses apoptosis resistance in FADD-or caspase-8-deficient cells by priming for tumor necrosis factorα-induced necroptosis［J］.Neoplasia，2011，13（10）：971－9.

［4］ Oltersdorf T，Elmore SW，Shoemarker A R，et al.An inhibitor of Bcl-2 family proteins induces regression of solid tumours［J］.Nature，2005，435（7042）：677－81.

［5］ Thome M，Schneider P，Hofmann K，et al.Viral FLICE-inhibitory proteins（FLIPS）prevent apoptosis induced by death receptors［J］.Nature，1997，386（6624）：517－21.

［6］ Irmler M，Thome M，Hahne M，et al.Inhibition of death receptor signals by celluar FLIP［J］.Nature，1997，388（6638）：190－5.

［7］ Shirley S，Micheau O.Targeting c-FLIP in cancer［J］.Cancer Lett，2013，332（2）：141－50.

［8］ Oztürk S，Schleich K，Lavrik I N，et al.Cellular FLICE-like inhibitory proteins（c-FLIPS）：fine-tuners of life and death decisions［J］.Exp Cell Res，2012，318（11）：1324－31.

［9］ Poukkula M，Kaunisto A，Hietakangas V，et al.Rapid turnover of c-FLIPshort is determined by its unique C-terminal tail［J］.J Biol Chem，2005，280（29）：27345－55.

［10］Safa A R，Pollok K E.Targeting the anti-apoptotic protein c-FLIP for cancer therapy［J］.Cancers，2011，3（2）：1639－71.

［11］Kim S，Lee T J，Park JW，Kwon T K.Overexpression of cFLIPSinhibits oxaliplatin-mediated apoptosis through enhanced XIAP stability and Akt activation in human renal cancer cells［J］.J Cell Biochem，2008，105（4）：971－9.

［12］Chang Z，Xing Z，Pan Y.c-FLIPLis a dual function regulator for caspase-8 activation and CD-95-mediated apoptosis［J］.EMBO J，2002，21（14）：3704－14.

［13］Longley D B，Wilson T R，McEwan M，et al.c-FLIP inhibits chemotherapy-induced colorectal cancer cell death［J］.Oncogene，2006，25（6）：838－48.

［14］Wilson T R，McLaughlin K M，McEwan M，et al.c-FLIP：A key regulator of colorectal cancer cell death［J］.Cancer Res，2007，67（12）：5754－62.

［15］El-Zawahry A，McKillop J，Voelkel-Johnson C.Doxorubicin increases the effectiveness of Apo2L／TRAIL for tumor growth inhibition of prostate cancer xenografts［J］.BMC Cancer，2005，5（2）：1－9.

［16］Chatterjee D，Schmitz I，Krueger A，et al.Induction of apoptosis in 9-nitrocamptothecin treated DU145 human prostate carcinoma cells correlates with de novo synthesis of CD95 and CD95 ligand and down-regulation of c-FLIP（short）［J］.Cancer Res，2001，61（19）：7148－54.

［17］Bijangi-Vishehsaraei K，Saadatzadeh M R，Huang S，et al.4-（4-Chloro-2-methyphenoxy）-N-hydroxybutanamide（CMH）targets mRNA of the c-FLIPvariants and induces apoptosis in MCF-7 human breast cancer cells［J］.Mol Cell Biochem，2010，342（1－2）：133－42.

［18］Lucas D M，Alinari L，West D A，et al.The novel deacetylase inhibitor AR-42 demonstrates pre-clinical activity in B-cell malignancies in vitro and in vivo［J］.PLoSOne，2010，5（6）：1－10.

［19］龔愛華，熊二夢，張 嚴，等.SAHA誘導的p21表達致U251MG細胞抗凋亡效應［J］.中國藥理學通報，2013，29（12）：1743－6.

［19］Gong A H，Xiong E M，Zhang Y.SAHA-induced p21 expression results in anti-apoptotic effects in U251MG cells［J］.Chin Pharmacol Bull，2013，29（12）：1743－6.

［20］Kinoshita H，Yoshikawa H，Shiiki K，et，al.Cisplatin（CDDP）sensitizes human osteosarcoma cell to Fas／CD95-mediated apoptosis by down-regulating FLIPLexpression［J］.Int J Cancer，2000，88（6）：986－91.

［21］Park SJ，Kim M J，Kim H B，et al.Trichostatin A sensitizes human ovarian cancer cells to TRAIL-induced apoptosis by down-regulation of c-FLIPLvia inhibition of EGFR pathway［J］.Biochem Pharmacol，2009，77（8）：1328－36.

［22］Jani T S，Devecchio J，Mazumdar T，et al.Inhibition of NF-kappaB signaling by quinacrine is cytotoxic to human colon carcinoma cell lines and is synergistic in combination with TRAIL or oxaliplatin［J］.J Biol Chem，2010，285（25）：19162－72.

［23］Yodkeeree S，Sung B，Limtrakul P，Aggarwal B B.Zerumbone enhances TRAIL-induced apoptosis through the induction of death receptors in human colon cancer cells：evidence for an essential role of reactive oxygen species［J］.Cancer Res，2009，69（16）：6581－9.

［24］Lee T J，Um H J，Min D S，et al.Withaferin a sensitizes TRAIL-induced apoptosis through reactive oxygen species-mediated up-regulation of death receptor 5 and downregulation of c-FLIP［J］.Free Radic Biol Med，2009，46（12）：1639－49.

［25］Li X，Huang Q，Ong C N，et al.Chrysin sensitizes tumor necrosis factor-alpha-induced apoptosis in human tumor cells via suppression of nuclear factor-kappaB［J］.Cancer Lett，2010，293（1）：109－16.

［26］Charette N，De Saeger C，Lannoy V，et al.Salirasib inhibits the growth of hepatocarcinomacell lines in vitro and tumor growth in vivo through ras and mTOR inhibition［J］.Mol Cancer，2010，9（256）：2－14.

［27］Wang W，Wang S，Song X，et al.The relationship between c-FLIP expression and human papillomavirus E2 gene disruption in cervical carcinogenesis［J］.Gynecol Oncol，2007，105（3）：571－7.

［28］ Bleumink M，K?hler R，Giaisi M，et al.Rocaglamide breaks TRAIL resistance in HTLV-1-associated adult T-cell leukemia／lymphoma by translational suppression of c-FLIP expression［J］.Cell Death and Differ，2011，18（2）：362－70.

［29］Son Y G，Kim E H，Kim JY，et al.Silibinin sensitizes human glioma cells to TRAIL-mediated apoptosis via DR5 up-regulation and down-regulation of c-FLIP and survivin［J］.Cancer Res，2007，67（17）：8274－84.

［30］Siegelin M D，Siegelin Y，Habel A，Gaiser T.Genistein enhances proteasomal degradation of the short isoform of FLIP in malignant glioma cells and thereby augments TRAIL-mediated apoptosis［J］.Neurosci Lett，2009，453（2）：92－7.

［31］Katz SI，Zhou L，Chao G，et al.Sorafenib inhibits ERK1／2 and MCL-1（L）phosphrylation levels resulting in caspase-independent cell death on malignant pleural mesothelioma［J］.Cancer Biol T-her，2009，8（24）：2406－16.

［32］Pawar P，Ma L，Byon CH，et al.Molecular mechanisms of tamoxifen therapy for cholangiocarcinoma：role of calmodulin［J］.Clin Cancer Res，2009，15（4）：1288－96.

［33］Yu Z，Wang R，Xu L，et al.β-Elemene piperazine derivatives induce apoptosis in human leukemia cells through downregulation of c-FLIP and generation of ROS［J］.PLoS One，2011，6（1）：1－10.

［34］Iwase M，Takaoka S，Uchida M，et al.Epidermal growth factor receptor inhibitorsenhance susceptibility to Fas-mediated apoptosis in oral squamous cell carcinoma cells［J］.Oral Oncol，2008，44（4）：361－8.

［35］Rishi L，Gahlot S，Kathania M，Majumdar S.Pentoxifylline induces apoptosis in vitro in cutaneous T cell lymphoma（HuT-78）and enhances FasL mediated killing by upregulating Fas expression［J］.Biochem Pharmacol，2009，77（1）：30－45.

［36］Olsson A，Diaz T，Aguilar-Santelises M，et al.Sensitization to TRAIL-induced apoptosis and modulation of FLICE-inhibitory protein in B chronic lymphocytic leukemia by actinomycin D［J］.Leukemia，2001，15（12）：1868－77.

［37］Chawla-Sarkar M，Bae SI，Reu F J，et al.Downregulation of Bcl-2，FLIP or IAPs（XIAP and survivin）by siRNAs sensitizes resistant melanoma cells to Apo2L／TRAIL-induced apoptosis［J］.Cell Death Differ，2004，11（8）：915－23.

［38］Day T W，Sinn A L，Huang S，et al.c-FLIPgene silencing eliminates tumor cells in breast cancer xenografts without affecting stromal cells［J］.Anticancer Res，2009，29（10）：3883－6.

［39］Jeon Y K，Kim H，Park S O，et al.Resistance to Fas-mediated apoptosis is restored by cycloheximide through the downregulation of cellular FLIPLin NK／T-cell lymphoma［J］.Lab Invest，2005，85（7）：874－84.

［40］Stagni V，Mingardi M，Santini S，et al.ATM kinase activity modulates cFLIP protein levels：potential interplay between DNA damage signalling and TRAIL-induced apoptosis［J］.Carcinogenesis，2010，31（11）：1956－63.

［41］Zhao X，Qiu W，Kung J，et al.Bortezomib induces caspase-dependent apoptosis in Hodgkin lymphoma cell lines and is associated with reduced c-FLIP expression：a gene expression profiling study with implications for potential combination therapies［J］.Leuk Res，2008，32（2）：275－85.

［42］Lin Y，Liu X，Yue P，et al.Involvement of c-FLIP and survivin down-regulation in flexible heteroarotinoid-induced apoptosis and enhancement of TRAIL-initiated apoptosis in lung cancer cells［J］.Mol Cancer Ther，2008，7（11）：3556－65.

［43］Kang Y J，Kim I Y，Kim E H，et al.Paxilline enhances TRAIL-mediated apoptosis of glioma cells via modulation of c-FLIP，survivin and DR5［J］.Exp Mol Med，2011，43（1）：24－34.

［44］Lee SJ，Noh H J，Sung E G，et al.Berberine sensitizes TRAIL-induced apoptosis through proteasome-mediated downregulation of c-FLIPand Mcl-1 proteins［J］.Int JOncol，2011，38（2）：485－92.

［45］Balkwill F.TNF-alpha in promotion and progression of cancer［J］.Cancer Metastasis Rev，2006，25（3）：409－16.

［46］Lu B，Finn O J.T-cell death and cancer immune tolerance［J］.Cell Death Differ，2008，15（1）：70－9.

［47］Naka T，Sugamura K，Bonnie L，et al.Effects of tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand alone and in combination with chemotherapeutic agents on patients＇colon tumors grown in SCID mice［J］.Cancer Res，2002，62（20）：5800－6.

［48］Majkut J，Sgobba M，Holohanl C，et al.Differential affinity of FLIP and procaspase8 for FADD’s DED binding surfaces regulates DISC assembly［J］.Nat Commun，2014，5（3350）：1－12.