黃芪甲苷對Th2型淋巴細胞D10.G4.1體外作用的研究

金華良，王利民，羅清莉，厲 蓓，杜懿杰，呂玉寶，董競成

（1.南京醫(yī)科大學附屬杭州醫(yī)院呼吸科，浙江 杭州 300021；2.復(fù)旦大學附屬華山醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，上海 200041）

Th2細胞因子在過敏性疾病（如哮喘）中發(fā)揮重要作用。研究證實其可促進B細胞分泌IgE，嗜酸性細胞聚集及氣道上皮粘液分泌，是氣道炎癥產(chǎn)生的主要機制［1］。黃芪甲苷屬于三萜皂苷類藥物，是傳統(tǒng)益氣類中藥黃芪的的主要活性成分，也是黃芪質(zhì)量控制的標準。本課題組前期發(fā)現(xiàn)黃芪可抑制哮喘模型 IL-4、IL-5、IL-13水平，改善氣道炎癥［2］。研究證實黃芪甲苷具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗纖維化等作用，對哮喘氣道炎癥及重塑均有較好的改善作用［3］。本課題組推測黃芪甲苷可抑制Th2型反應(yīng)，但目前報道多為對脾淋巴細胞等模型的干預(yù)研究。本研究采用D10.G4.1（D10）淋巴細胞，其為目前公認的Th2淋巴細胞株，旨從細胞水平探討黃芪甲苷對Th2型反應(yīng)的免疫調(diào)節(jié)機制。

1 材料與方法

1.1 材料 D10細胞株來源：購于美國ATCC公司，貨號：TIB-224TM；黃芪甲苷（純度：＞99%）購于上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司；地塞米松注射液由山東新華制藥股份有限公司提供；刀豆素蛋A（concanavalin A，ConA）、碘化丙啶（propidium iodide，PI）購于美國 Sigma公司；RPMI 1640完全培養(yǎng)液、胎牛血清、2-巰基丙醇購自美國Gibco公司；TSTIM購于美國BD公司；小鼠IL-1α購于美國R＆D公司；細胞增殖-毒性檢驗試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8）購自日本同仁化學研究所；IL-4、IL-5、IL-13、TNF-α酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒購于上海西唐生物醫(yī)藥公司；gata-3兔抗小鼠多克隆抗體購于美國Santa Cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組 ① 空白組：將D10細胞予完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)，予培養(yǎng)基對照處理。② ConA組：將D10細胞予完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)，予以50 mg·L－1ConA。③地塞米松（Dex）組：將D10細胞予完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)，予以10－8mol·L－1Dex。④、⑤、⑥ 黃芪甲苷低、中、高劑量組：將D10細胞予完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)，予以 50 mg·L－1ConA，及分別為 2、4、8×10－5mol·L－1黃芪甲苷。

1.2.2 D10細胞株培養(yǎng)條件 RPMI 1640培養(yǎng)基，10%T-STIM和 Con A，10% 胎牛血清，0.05 mmol·L－12-巰基丙醇，10 ng·L－1小鼠 IL-1α，在 37.0℃，5%CO2條件下培養(yǎng)。

1.2.3 CCK-8法檢測細胞毒性及細胞增殖 細胞毒性實驗：無菌條件下，向96孔培養(yǎng)板中依次加入D10細胞懸液，使每孔細胞數(shù)為104，再加入黃芪甲苷（使終濃度為2、4、8×10－5mol·L－1）或地塞米松（終濃度為10－8mol·L－1）或等體積培養(yǎng)基，共孵育48 h。最后加入10μl CCK-8試劑，37℃孵育3 h。

細胞增殖實驗：先用黃芪甲苷（使終濃度分別為2、4、8×10－5mol·L－1）或地塞米松（終濃度為10－8mol·L－1）或等體積培養(yǎng)基預(yù)處理D10細胞2 h，然后每孔加入 ConA（終濃度為 50 mg·L－1），共刺激48 h。最后加入10μl CCK-8試劑，37℃孵育3 h。最后采用酶標儀測定吸光度值，讀取波長為570 nm。

1.2.4 流式細胞儀檢測細胞凋亡與周期 無菌條件下，向12孔培養(yǎng)板中依次加入D10細胞懸液，使每孔細胞數(shù)為106，加入黃芪甲苷（使終濃度分別為2、4、8×10－5mol·L－1）或地塞米松（終濃度為 10－8mol·L－1）或等體積培養(yǎng)基預(yù)處理2 h。再加入ConA（終濃度為 50 mg·L－1），共刺激 48 h后，收集細胞懸液。1 000 r·min－1離心收集細胞。冰70%乙醇4℃固定2 h。離心細胞去除乙醇，用PBS洗1遍。加PI染色液放置1 h后上流式細胞儀，檢測細胞凋亡比例及細胞周期。

1.2.5 ELISA檢測D10細胞培養(yǎng)上清細胞因子

無菌條件下，向24孔培養(yǎng)板中依次加入D10細胞懸液，使每孔細胞數(shù)為105，加入黃芪甲苷（使終濃度分別為2、4、8×10－5mol·L－1）或地塞米松（終濃度為10－8mol·L－1）或等體積培養(yǎng)基預(yù)處理 2 h。再加入ConA（終濃度為50 mg·L－1），共刺激48 h后，收集細胞懸液，1 500 r·min－1，5 min，收集細胞上清液，采用 ELISA法測定 IL-4、IL-5、IL-13、TNF-α水平，具體操作參照廠家說明書進行。

1.2.6 Western blot測定D10細胞gata-3表達水平

無菌條件下，向6孔培養(yǎng)板中依次加入D10細胞懸液，使每孔細胞數(shù)為2×106，加入黃芪甲苷（使終濃度分別為2、4、8×10－5mol·L－1）或地塞米松（終濃度為10－8mol·L－1）或等體積培養(yǎng)基預(yù)處理2 h。再加入ConA（終濃度為50 mg·L－1），共刺激48 h后，收集細胞，提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。灌注凝膠，上樣，電泳60V×30 min后改用80 V恒壓電泳；300 mA恒流轉(zhuǎn)膜90 min；封閉2 h；加入TBST稀釋的gata-3抗體，4℃過夜；加羊抗兔二抗，室溫2 h；ECL顯色后將濾膜在暗室曝光后顯影，定影，使用Quantity One軟件進行條帶光密度值掃描。以β-actin作內(nèi)參對照。

1.2.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)采用ˉx±s表示，凡符合方差齊性的數(shù)據(jù)，采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），兩組間比較采用Dunnett法。對不符合方差齊性的數(shù)據(jù)，則進行秩和檢驗（Kruskal-Wallis法），多組間兩兩比較采用Mann-Whiteney-U法。

Fig 1 Effects of AS and／or ConA on D10 cell viability＃P＜0.05 vs blank group；*P＜0.05 vs ConA group

2 結(jié)果

2.1 黃芪甲苷對D10淋巴細胞體外增殖的影響細胞毒性實驗結(jié)果顯示，培養(yǎng)48h后，地塞米松可明顯抑制D10細胞活性（P＜0.05），而不同濃度的黃芪甲苷（2、4、8×10－5mol·L－1）對 D10細胞活性無明顯影響（P＞0.05）；加入 5 mg·L－1ConA刺激后，細胞活性明顯提高（P＜0.05）；地塞米松可明顯抑制ConA誘導(dǎo)的細胞增殖（P＜0.05）；不同濃度的黃芪甲苷（2、4、8×10－5mol·L－1）對 D10細胞活性無明顯影響（P＞0.05）。見Fig 1。

2.2 黃芪甲苷對D10細胞體外凋亡和細胞周期的影響 結(jié)果顯示，ConA組凋亡較正常組明顯減少（P＜0.05）；地塞米松組較ConA組細胞凋亡明顯增多（P＜0.05），G0／G1期細胞比例明顯增加（P＜0.01），而 S期和G2／M期細胞比例明顯減少（P＜0.01）。黃芪甲苷低、中、高劑量組D10細胞G0／G1期、S期均無明顯變化（P＞0.05），而高劑量組G2／M期細胞比例較ConA組明顯減少（P＜0.05）。以上說明黃芪甲苷在本實驗濃度內(nèi)對D10細胞無明顯的促凋亡作用，但高劑量組對細胞周期有一定影響。見 Fig 2、3，Tab 1。

Fig 2 Representative plots of flow cytometry of cycle distribution

Fig 3 Effects of AS on apoptosis of D10 cells＃P＜0.05 vs blank group；*P＜0.05 vs ConA group.

2.3 黃芪甲苷對培養(yǎng)上清中細胞因子（IL-4、IL-5、IL-13、TNF-α）的影響 結(jié)果顯示，培養(yǎng)48 h后，ConA組較正常組IL-4、IL-5、IL-13及TNF-α水平均明顯升高（P＜0.05），地塞米松組 IL-4、IL-5、IL-13及TNF-α水平明顯下降（P＜0.05，P＜0.01）；黃芪甲苷高劑量組可明顯下降D10細胞培養(yǎng)上清中IL-13水平（P＜0.01），而低劑量組TNF-α水平明顯下降（P＜0.01）。但黃芪甲苷各劑量組對 IL-4、IL-5水平無明顯影響（P＞0.05）。見Fig 4。

2.4 黃芪甲苷對D10細胞gata-3表達水平的影響

結(jié)果顯示，ConA組較空白組gata-3表達水平明顯增加（P＜0.05）；而地塞米松組gata-3表達水平明顯降低（P＜0.05）；黃芪甲苷高劑量組gata-3表達水平較ConA組明顯下降（P＜0.05），而低、中劑量組無明顯差異（P＞0.05）。見Fig 5。

Tab 1 Effect of ASon cycle distribution of D10 cells

3 討論

現(xiàn)代藥理學研究表明，黃芪甲苷具有良好的免疫調(diào)節(jié)作用，可抗炎、抗氧化、抗病毒等作用［4－6］。哮喘是Th2淋巴細胞等介導(dǎo)的氣道炎癥性疾病。既往的研究［7］提示黃芪甲苷可調(diào)節(jié)T、B淋巴細胞增殖，但罕見對Th2型淋巴細胞作用的相關(guān)報道。因此，本研究通過探討黃芪甲苷體外干預(yù)Th2淋巴細胞株（D10細胞）的作用，進一步闡明黃芪甲苷對哮喘等疾病的作用機制，為臨床應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

為探討黃芪甲苷是否存在細胞毒性作用，本研究首先檢測藥物對細胞活性的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在有、無ConA刺激時，黃芪甲苷在本實驗濃度下（2、4、8×10－5mol·L－1）對 D10細胞活性均無明顯影響，說明在本實驗濃度下，黃芪甲苷對D10細胞無細胞毒性作用。地塞米松在有、無ConA刺激的條件下，均可明顯抑制D10細胞的活性，說明本實驗濃度下的地塞米松（10－8mol·L－1），對 D10細胞具有一定的細胞毒性。

Fig 4 Effects of ASon cytokines in culture supernatants of D10 cells＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs blank group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs ConA group

Fig 5 Effects of AS on gata-3 expression of D10 cells＃P＜0.05 vs blank group；*P＜0.05 vs ConA group.

凋亡和細胞周期的檢測可進一步分析藥物對細胞增殖的影響。本研究發(fā)現(xiàn)，與ConA組比較，低、中、高劑量組黃芪甲苷對D10細胞凋亡均無明顯影響，進一步證實本實驗濃度下黃芪甲苷對D10細胞無細胞毒性。但黃芪甲苷高劑量組G2／M期細胞比例明顯減少，說明一定劑量的黃芪甲苷可減緩細胞的有絲分裂。而地塞米松組D10細胞凋亡明顯增加，G0／G1期的細胞比例時間明顯上調(diào)，而S與G2／M期的細胞比例明顯減少，提示地塞米松可以抑制D10細胞內(nèi)DNA合成，促使細胞停滯在靜止期。

IL-4、IL-5及IL-13是經(jīng)典的Th2型淋巴細胞因子，也是哮喘氣道炎癥的主要炎癥介質(zhì)［8］。研究已證實黃芪甲苷可抑制氣道炎性因子水平，減少嗜酸性粒細胞聚集，從而改善氣道炎癥［9］。本課題從體外研究發(fā)現(xiàn)，黃芪甲苷對Th2型細胞因子IL-4及IL-5水平無明顯影響，但可明顯抑制IL-13水平。IL-13在哮喘發(fā)病機制中發(fā)揮多種功能，可促進氣道粘液分泌，加重氣道炎癥及氣道高反應(yīng)性［10］。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，低劑量組黃芪甲苷可抑制TNF-α水平。TNF-α可以促進嗜酸性粒細胞和中性粒細胞的募集，促進T細胞活化，上調(diào)黏附分子ICAM-1和VCAM-1的表達，從而加重哮喘氣道炎癥［11］。以上提示黃芪甲苷體內(nèi)改善哮喘氣道炎癥，其作用可能與抑制Th2細胞IL-13及TNF-α水平相關(guān)。本實驗中，地塞米松組IL-4、IL-5、IL-13及 TNF-α水平明顯下降，但其作用可能與其明顯抑制D10細胞活性相關(guān)。

為進一步分析黃芪甲苷對D10細胞的作用，本研究檢測了gata-3表達的變化。gata-3是Th2淋巴細胞分化成熟的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，對Th2型細胞因子水平具有重要影響。本研究發(fā)現(xiàn)，黃芪甲苷高劑量組可明顯抑制gata-3表達。研究認為gata-3可調(diào)控IL-13基因的轉(zhuǎn)錄表達，與其蛋白表達水平密切相關(guān)［12］。因此，黃芪甲苷降低IL-13水平，可能與其抑制gata-3水平相關(guān)。gata-3表達水平對IL-4、IL-5細胞因子也具有重要影響，但本實驗中黃芪高劑量組IL-4及IL-5水平與ConA組無明顯差異。一方面，細胞因子的表達水平受細胞內(nèi)、外環(huán)境的影響，本實驗采用ConA為促有絲分裂原，可選擇性刺激T細胞增殖，因此IL-4及IL-5水平升高與D10細胞增殖密切相關(guān)，而gata-3水平的變化并未影響ConA促進細胞因子（IL-4及IL-5）的表達。黃芪甲苷可抑制IL-13水平，推測除抑制gata-3外，可能存在其它作用機制，有待進一步研究證實。另一方面，gata-3對IL-4及IL-5的調(diào)節(jié)首先表現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄水平，故而進一步實驗可檢測黃芪甲苷對IL-4及IL-5mRNA水平的影響。

綜上，本研究證實黃芪甲苷體外具有抑制Th2反應(yīng)的作用，這可能是黃芪甲苷治療哮喘的作用基礎(chǔ)。至于黃芪甲苷調(diào)節(jié)gata-3表達機制，有待進一步研究。

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