CD44單抗A3D8對NB4細胞IL-3Rα及其下游信號通路的調節

陳 萍，原 琴，姜 熙，伍娟英，黃慧芳

（福建省血液病研究所，福建省血液病學重點實驗室，福建醫科大學附屬協和醫院，福建福州 350001）

CD44屬于黏附分子家族的Ⅰ型跨膜糖蛋白，根據所含外顯子類型不同可將CD44分為兩類：由10個組成型外顯子編碼的標準型CD44（CD44s）和10個變異型外顯子選擇性地進行剪切產生的變異型CD44（CD44v）。在正常造血過程中，CD44已被證實參與正常髓系分化及多種細胞－細胞和細胞－胞外基質的相互作用，并且具有信號分子的功能［1］。近年來大量研究表明 CD44，尤其是 CD44v與造血系統惡性腫瘤如急／慢性白血病、淋巴瘤及多發性骨髓瘤等，特別是急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）有密切聯系［2－4］。Bendall等［4］比較了30例AML患者白血病細胞與正常外周血單個核細胞（PBMC）及骨髓（BM）CD34＋造血干細胞CD44變異體的表達情況，結果發現，AML細胞的CD44變異體的組合方式較正常造血祖細胞更為復雜。此外，AML病人高表達CD44-6v還提示其預后欠佳［5］。A3D8（IgG1）是一種鼠源性的抗 CD44單克隆抗體，可與CD44膜外區糖蛋白結合，通過抑制c-Jun啟動子的活性，下調c-Jun的表達或穩定細胞內p27Kip1水平誘導各個亞型的AML細胞發生分化和凋亡［6－7］。

IL-3Rα即IL-3受體α亞基，被認為是AML干細胞（AML-LSCs）的一個獨特標志，在正常造血干細胞極少表達。體外研究表明，IL-3Rα高表達可以提高細胞對IL-3的敏感性，從而激活下游的PI3K／Akt等信號通路，傳遞生存信號，有利于形成IL-3非依賴的克隆或在極低劑量IL-3的刺激下即能增殖。臨床研究發現，在AML患者中，高表達IL-3Rα與高白細胞數、高原始細胞和預后差有關，通過檢測IL-3Rα的水平可以判斷白血病細胞增殖狀況，對緩解后的AML患者進行復發率和生存率的預測［8］。已有學者認為，針對IL-3Rα的靶向治療可清除AML干細胞［9］。但迄今為止對于CD44單抗A3D8能否調節IL-3Rα及下游信號通路的表達未見報道。本研究以急性早幼粒細胞株NB4細胞為研究對象，探討A3D8對IL-3Rα及下游PI3K／Akt信號通路的表達調節。

1 材料與方法

1.1 細胞株及培養條件 人急性早幼粒細胞白血病細胞株NB4由福建醫科大學附屬協和醫院檢驗科鄭培烝博士惠贈。細胞培養條件：含10%FBS（天津灝洋生物）常規劑量青、鏈霉素的RPMI 1640培養液（Gibco公司），37℃、5%CO2、飽和濕度的培養箱中培養，每2 d半量換液，取對數生長期且細胞存活率（臺盼藍拒染法）＞95%的細胞進行實驗。

1.2 藥物 CD44單抗 A3D8（C7923）購自 Sigma公司。由于A3D8原液中含有的疊氮化鈉會非特異殺傷細胞，使用前應將其用10k超濾管（Millipore公司）8 000×g，5min離心數次后，將超濾管管芯反向放入一新的套柱中，1 000×g，5 min離心數次后得到純化的A3D8。同型對照的鼠IgG1抗體購自廣州英韋創津公司，臨用前用PBS稀釋至所需濃度。LY294002配制：LY294002購自CST公司，用DMSO溶解成10 mmol·L－1保存，RPMI 1640培養液稀釋至即用濃度。

1.3 實時定量 RT-PCR檢測 NB4細胞 IL-3Rα mRNA表達 收集A3D8與同型對照處理后的NB4細胞，用TRIzol法提取總RNA，準確定量后反轉錄為cDNA（Promega公司），再采用SYBR Green（BD公司）進行定量 PCR。反應體系：2×SYBR Green Master（ROX）12.5μl，上下游引物終濃度為 0.2 μmol·L－1，cDNA 2.5μl，RNase-free water加至 25 μl。引物序列如下：β-actin正向引物 5′-AGTGTGACGTGGACATCCGCAA-3′，反 向 引物 5′-ATCCACATCTGCTGGAAGGTGGAC-3′；IL-3Rα 正 向 引 物5′-GACCTGTACTTGAACGTTGCC-3′，反向引物 5′-GAAACGACACCCGATACGTGT-3′。擴 增 條 件 為95℃預變性 10 s；95℃，15 s；55℃，10 s；40個循環；68℃，20 s。以 β-actin為內參，采取 2－ΔΔCT相對定量分析各基因的變化情況。

1.4 Western blot檢測 NB4細胞中 IL-3Rα蛋白表達及PI3K／Akt信號通路的變化 收集分別經A3D8與同型對照處理后的2×106個NB4細胞，經勻漿裂解后，離心收集上清，用Brandford法定量。各取40μg總蛋白，用SDS-PAGE電泳后轉至PVDF膜，室溫下封閉2 h，一抗4℃孵育過夜，洗滌后與辣根過氧化物酶標記的二抗孵育2 h，進行化學發光法反應。抗β-actin單抗為Santa Cruz公司產品；抗IL-3Rα單克隆抗體購自 Abcam公司；抗 Akt、p-AktSer473、抗p-AktThr308、抗p-PDK1單抗均為CST公司產品，抗鼠二抗及抗兔二抗購自CST公司。

1.5 PI3K／Akt信號通路抑制劑 LY294002聯合A3D8對NB4細胞增殖及凋亡的影響 NB4細胞按1×104／孔接種入96孔板，分別設置 LY294002處理組（10μmol·L－1）、A3D8（4 mg·L－1）處理組及二者聯合組，每組設3個平行孔，置于細胞培養箱中孵育48 h，采用 MTT比色法檢測，具體見文獻［6］。抑制率／%＝（未處理組OD值－實驗組OD值）／未處理組OD值×100%。細胞凋亡采用Annexin V-FITC／PI雙染流式細胞術，收集細胞，按Annexin-V-FITC／PI細胞凋亡檢測試劑盒（Roche公司）說明書操作，在流式細胞儀（BD公司）上檢測。

2 結果

2.1 A3D8可下調IL-3RαmRNA的表達 Realtime PCR結果顯示，經4 mg·L－1A3D8處理后，IL-3RαmRNA表達水平下降，24、48和72 h分別為對照組的（28.1±3.2）%、（15.4±2.7）%和（16.7±1.9）%，見 Fig 1。

Fig 1 Expression of IL-3RαmRNA in NB4 treated with isotype control or A3D8**P＜0.01 vs control

2.2 A3D8可抑制NB4細胞IL-3Rα蛋白的表達及抑制其下游PI3K／Akt信號通路 4 mg·L－1A3D8作用于NB4細胞24 h后，IL-3Rα蛋白表達下調，p-AktSer473、p-AktThr308、p-PDK1蛋白水平下調，見 Fig 2。

Fig 2 Expression of IL-3Rαprotein and level of phosphorylation of Akt in NB4 treated with isotype control or A3D8

2.3 LY294002可增強A3D8對NB4細胞增殖抑制和凋亡的誘導 PI3K／Akt信號通路抑制劑LY294002與A3D8聯合，可增強對NB4細胞增殖抑制（Fig 3）及凋亡的誘導（Fig 4）。

2.4 LY294002可增強 A3D8對NB4細胞PI3K／Akt信號通路的抑制 LY294002與A3D8聯合可進一步抑制PI3K／Akt信號通路，通路中的信號分子p-AktSer473、p-AktThr308、p-PDK1蛋白水平進一步下調（Fig 5）。

3 討論

CD44是一個跨膜的糖蛋白分子，在許多惡性的實體腫瘤組織如肝癌、胃癌、乳腺癌、直腸癌等中都有高表達，且表達水平與腫瘤的轉移、預后密切相關［10］。近10年來，許多研究表明，CD44對血液腫瘤，特別是AML細胞的增殖、分化、凋亡、耐藥發揮著至關重要的作用，并被認為是AML-LSCs的標志之一。因此，運用針對 CD44的單克隆抗體治療AML成為研究熱點［11］。

一系列的研究結果表明，A3D8可抑制各亞型AML細胞的增殖，并能促使AML細胞分化和凋亡。Gadhoum等［7］研究表明，A3D8能夠穩定 p27Kip1，增加cyclinE／Cdk2復合物的形成，從而抑制NB4細胞的增殖。IL-3Rα是AML-LSCs的一個獨特標志，還有研究認為其可用于監測APL的微小殘留病灶。在本課題的前期研究中，我們發現維甲酸（ATRA）無法下調NB4細胞IL-3Rα的表達，而三氧化二砷（As2O3）則能下調［12］。由于 A3D8被證實對耐 ATRA的NB4細胞及耐As2O3的原代APL細胞仍具有殺傷作用，因此，我們推測A3D8可能對NB4細胞的IL-3Rα蛋白也具有抑制作用。我們的結果證實了我們的推測，A3D8誘導NB4細胞分化和凋亡過程中，可以下調IL-3RαmRNA和蛋白水平表達。

Fig 3 Effects of LY294002，A3D8 and LY294002 followed by A3D8 on the proliferation of NB4 cells*P＜0.05 vs LY294002 and A3D8

Fig 4 Effects of LY294002，A3D8 and LY294002 followed by A3D8 on the apoptotic rate of NB4 cells*P＜0.05 vs LY294002 and A3D8

Fig 5 Level of phosphorylation of Akt in NB4 treated with LY294002，A3D8 and LY294002 followed by A3D8

PI3K／Akt信號通路是調控腫瘤細胞增殖、分化與凋亡的重要通路之一，在許多惡性血液病中可以檢測到該通路的異常激活［13－15］。同時，該通路也是IL-3Rα分子信號傳導中的重要通路。在這一通路中，p-Akt的激活可通過激活下游一系列信號分子從而發揮抗凋亡的作用。我們的研究顯示，A3D8作用于NB4細胞24 h后，明顯下調PI3K／Akt信號通路上的p-AktSer473、p-AktThr308蛋白水平，抑制該通路。將該通路抑制劑與A3D8聯合，可協同抑制NB4細胞增殖，并進一步抑制NB4細胞中該通路的重要信號分子的蛋白水平。PI3K／Akt信號通路是聯系AML和骨髓基質細胞的重要通路，IL-3Rα被認為可作為殘留APL的標記，這提示我們A3D8可能對阻斷APL和基質細胞間的聯系，清除骨髓中殘留APL細胞發揮作用。

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