hi FGF2真核表達載體的構建及其高表達對細胞凋亡的影響

陳鐘琳，姜紅巖，洪曉冰，陳中華，鄭燕珊，徐 涵，石剛剛，黃展勤

（1.汕頭大學醫學院附屬腫瘤醫院，2.汕頭大學醫學院藥理學教研室，廣東汕頭 515041）

成纖維細胞生長因子2（fibroblast growth factor-2，FGF-2），也稱作堿性成纖維生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF），廣泛參與細胞的生長、分化、遷移、血管生成及腫瘤的發生等過程。FGF-2基因定位于人類染色體的4q26，全長38kb，含有3個外顯子和2個內含子。由于其mRNA有多個翻譯起始位點，可以產生18 ku的低分子量亞型（lo FGF2）和23 ku的高分子量亞型（hi FGF2），低分子量亞型在細胞質和細胞膜中表達，高分子量亞型則主要直接進入細胞核中發揮作用。具有活性的FGF-2可通過肝素硫酸鹽蛋白多糖（heparin sulfate proteoglycans，HSPG），與酪氨酸激酶受體性質的成纖維細胞生長因子受體（fibroblast growth factor receptor，FGFR）結合，激活 PKC、Ras／Raf／MEK／ERK、P13K、JAK／STAT等信號傳導通路，參與調節細胞增殖，分化和惡性轉化［1－2］。

在心血管系統，有研究結果證明FGF-2參與了壓力負荷和血管緊張素引起的心肌肥厚［3］；AngⅡ與受體結合刺激心肌細胞和心肌成纖維細胞分泌FGF-2，并激活MAPK信號通路導致心肌肥厚，心臟功能惡化［4－5］。但是，也有研究表明 FGF-2可以引起細胞染色質濃縮，抑制增殖和引起細胞凋亡［6］。顯然，FGF-2在心血管中的作用尚不完全明了。

為了進一步研究hi FGF2的生物學意義及其機制，本實驗構建 hi FGF2的真核表達載體，并在HEK293細胞中過表達后，觀察其對HEK293細胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 重組質粒hi FGF2（23 ku）-pD-sRed1-N1（由德國 Hannover大學 Prof.Dr.Peter Claus饋贈），HEK293細胞株（中國細胞庫），LipofectamineTM2000 Reagent（Invitrogen公司），E.coli Trans1-T1感受態細胞（北京全式金公司），Nhel限制性內切酶、EcoRI限制性內切酶（美津生物技術公司），膠回收試劑盒（天根生物技術公司），質粒小提／中提試劑盒（BIOMIGA公司），高糖DMEM培養液、胎牛血清（HyClone公司），Annexin V-FITC／PI雙染法細胞凋亡檢測試劑盒（Mbchem公司），兔抗大鼠FGF-2單克隆抗體（Epitomics公司）。

1.2 實驗分組 實驗分成3組：正常組（Control）、轉染空載體（Vector）組、轉染質粒（hi FGF2）組。

1.3 pDsRed1-N1真核表達載體的構建 質粒FGF2（23 ku）-pDsRed1-N1的 cDNA用 Nhel和 Eco-RI雙酶切后，瓊脂糖凝膠電泳后根據載體DNA片段大小切膠（約4 700 bp），用膠回收試劑盒回收純化所切片段，得到少量載體DNA。載體DNA用感受態細胞Trans1-T1進行轉化，在LB固體培養基中擴增長出菌落，最后用去內毒素質粒小提試劑盒抽提純化出質粒DNA，即構建出pDsRed1-N1真核表達載體。用Nhel和EcoRI進行酶切鑒定，瓊脂糖凝膠電泳。

1.4 FGF2在HEK293細胞中的轉染 200 ml的DMEM（無血清）中加入4.0μg DNA，柔和混勻；200 μl／孔無血清 DMEM稀釋10μl／孔 lipofectamin 2000試劑，輕輕混勻，室溫放置5 min；將稀釋好的DNA和lipofectamin 2000試劑輕柔混勻，室溫放置20 min。將400μl上述復合物加入到細胞中，細胞在37℃、5%CO2培養箱中孵育24 h后可通過倒置熒光顯微鏡觀察到熒光，檢測轉染效率。

1.5 FGF2在HEK293細胞中過表達后的檢測FGF2在HEK293細胞中轉染48 h內提取總蛋白進行Western blot檢測。一抗為兔抗FGF2單克隆抗體，二抗為羊抗兔多克隆抗體，化學發光液為底物。

1.6 檢測過表達hi FGF2后細胞凋亡 用Annexin V-FITC／PI雙染法細胞凋亡試劑盒檢測過表達hi FGF2后細胞凋亡的情況。pDsRed1-N1-hi FGF2質粒轉染至HEK293細胞后24 h，用不含EDTA的胰酶消化收集，用冷PBS洗滌細胞兩次，每次2 000 r·min－1，5 min離心收集細胞；用400μl 1×Binding Buffer懸浮細胞；在細胞懸液中加入5μl Annexin VFITC，輕輕混勻避光孵育15 min；加入10μl PI后輕輕混勻避光孵育5 min；1 h內用熒光顯微鏡檢測。細胞分組：陰性組，單染FITC組，單染 PI組，雙染FITC-PI組。

1.7 統計學方法 實驗結果用SPSS 13.0統計軟件分析，結果以±s表示，采用單因素方差分析進行組間比較。

2 結果

2.1 HI FGF2的鑒定及真核表達載體的構建HEK293細胞RNA經逆轉錄聚合酶鏈反應法得到約1 000 bp的DNA條帶，酶切克隆至pDsRed1-N1中，PCR擴增hi FGF2質粒在23 ku的基因片段，瓊脂糖凝膠電泳檢測得到含hi FGF2 cDNA的真核表達載體，條帶指示約在5500 bp和90 bp（Fig1）。DNA測序證實其全長開放讀碼框與真核表達載體的讀碼框吻合，得到pDsRed1-N1-hi FGF2。

Fig 1 hi FGF2 plasmid and p DsRed1-N1 vector was detected by gel Agarose gel electrophoresis1：The hi FGF2-pDsRed1-N1 DNA，the bands are about 5 500bp and 90bp.2，3：The pDsRed1-N1 DNA，the band is about 5 000 bp.

2.2 熒光倒置顯微鏡觀測HI FGF2的轉染效率由于目的基因片段插入載體pDsRed1-N1中，且帶紅色熒光蛋白，所以進行質粒hi-FGF2-pDsRed1-N1轉染后，有質粒轉入的細胞在熒光倒置顯微鏡下可觀測到紅色熒光，從而判斷質粒的轉染效率（Fig 2）。

Fig 2 Transfection of hi FGF2-pDsRed1-N1 in HEK293 cellsThe red fluorescence represents that hi FGF2-pDsRed1-N1 has been transfected into the HEK293 cells.

2.3 Western blot檢測HI FGF2在HEK293細胞中的表達 Westerm blot檢測pDsRed1-N1-hi FGF2轉染的HEK293細胞中hi FGF2的表達，在約50 ku處出現了特異性免疫反應條帶（Fig 3），而未經轉染細胞對照無相應條帶，表明 hi FGF2成功轉入HEK293細胞中，并表達hi FGF2重組蛋白。

Fig 3 Over-expression of hi FGF2-pDsRed1-N1 in HEK293 cells1：Nomal cultured HEK293 cells；2：HEK293 cells which were transfected with hi FGF2-pDsRed1-N1.

2.4 表達HI FGF2引起細胞凋亡 FITC-Annexin V／PI雙染法檢測細胞凋亡。在流式細胞散點分析圖上劃十字門，正常細胞FITC及PI均低染（FITCPI－），圖上顯示為左下區細胞簇；早期凋亡細胞FITC高染而PI低染（FITC＋PI－），圖上顯示為右下區細胞簇；晚期凋亡及死亡細胞FITC及PI均高染（FITC＋PI＋），圖上顯示為右上區細胞簇（Fig 4 A，B，C）。比較早期凋亡和晚期凋亡，空載體轉染組（Vector組）（Fig 4B）比正常未轉染組（Control組）（Fig 4A）凋亡細胞增多，其差別有統計學意義（P＜0.05），質粒轉染組（Fig 4C）比正常未轉染組和空載體轉染組細胞凋亡明顯增多，差異均有統計學意義（P＜0.05）。說明當過表達質粒 pDsRed1-N1-hi FGF2時，明顯促進細胞凋亡。

Fig 4 Over-expression of Hi-FGF2 induced cell apoptosisA：Normal cultured HEK293 cells（Control）；B：HEK293 cells which were transfected with empty vector pDsRed1-N1（Vector）；C：HEK293 cells which were transfected with hi FGF2-pDsRed1-N1（hi FGF2）.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control；＃P＜0.05 vs vector

3 討論

HEK293細胞是一種來源于人體腎臟的細胞株，且比較容易轉染，是一個很常用的研究表達外源基因的細胞株。綜合大量的文獻和前期研究，選擇HEK293細胞株作為初步研究轉染和生物活性的功能性細胞，是一個最佳選擇［7］。本實驗選用HEK293細胞株作為實驗載體，并成功進行 pD-sRed1-N1-hi FGF2的轉染，為研究hi FGF2的生物學功能奠定基礎。

已有研究表明，hi FGF2過表達會使半胱氨酸天冬氨酸蛋白激酶3（caspase-3）活化，同時下調Akt磷酸化水平。Miyamoto等［8］指出，多種病理損傷，包括缺血和再灌注、壓力超負荷、缺氧、低血糖和心臟毒性藥物能夠激活Akt，阻止心肌細胞凋亡。Akt磷酸化水平一旦降低，其促細胞存活的作用也將隨之降低，加上執行caspase-3的激活，標志細胞凋亡的引發［9］。本實驗結果證實 hi FGF2轉染到HEK293細胞過表達后會導致細胞凋亡。

本實驗重組質粒hi FGF2-pDsRed1-N1的成功構建，為我們的下一步深入研究提供有利的實驗條件。在本實驗結果基礎上，我們將進一步擴展研究hi FGF2導致細胞凋亡可能的作用機制，如對細胞中Akt磷酸化水平的影響，以及B23、p68、C1QBP等多種蛋白質的相互作用后所產生的生物效應。

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