拮抗細菌Y13對油茶炭疽病防治試驗

高月庭，周國英*，何小勇，王明月

（1. 中南林業科技大學 經濟林培育與保護教育部重點實驗室，湖南 長沙 410004；2. 浙江省麗水市林業科學研究院研究生工作站，浙江 麗水 323000；3. 浙江省麗水市林業有害生物防治檢疫總站，浙江 麗水 323000）

拮抗細菌Y13對油茶炭疽病防治試驗

高月庭1，周國英1*，何小勇2，王明月3

（1. 中南林業科技大學 經濟林培育與保護教育部重點實驗室，湖南 長沙 410004；2. 浙江省麗水市林業科學研究院研究生工作站，浙江 麗水 323000；3. 浙江省麗水市林業有害生物防治檢疫總站，浙江 麗水 323000）

通過設計2個單因素試驗，以施用濃度和施用時間為因素，分別選取3個水平，以防治效果、嚴重度和Y13對生長影響作為指標，進行單因素方差分析的多重比較。結果表明，兩組單因素實驗對油茶成林炭疽病均起到了良好的防治效果；當Y13濃度達到1010cfu/mL時，防治效果最高，炭疽病的嚴重度最低，葉片生長量最高；4月和6月同時施用使生防效果達到最優，可見高濃度和多次數施用是防治成林炭疽病重要的影響因子。

油茶炭疽病；內生拮抗細菌；生物防效；影響因子

油茶（Camellia oleifera）是我國南方特有的食用油料樹種，亦是世界四大木本油料樹種之一[1]，已有2 000多年的栽培歷史。它抗逆性強，適應性廣，以湖南、浙江、江西、廣西為主，適種于廣大的紅壤丘陵低地區。油茶炭疽病（Anthracnose）是油茶常見病害之一，在我國油茶產區普遍發生，引起嚴重落果、落蕾、落葉、枝枯，甚至整株衰亡[2]。據調查，浙江省油茶炭疽病嚴重病區發病率高達 80%，病樹的平均存果率比無病樹降低了63.3%，造成嚴重的經濟損失[3]。因此，提高油茶炭疽病的防治技術，特別是探索生物防治技術，是油茶生產的當務之急。

Y13是由中南林業科技大學經濟林培育與保護教育部重點實驗室從健康油茶葉片中分離篩選的拮抗細菌，經鑒定為枯草芽孢桿菌，對油茶炭疽病的平板抑菌率達到84.1%[4]，盆栽試驗防治效果也達到了77.23%[5]，具有十分廣闊的應用前景。本實驗擬對影響該菌株的生物防效的二種重要因素進行林間試驗，探究在自然微生態環境下Y13對油茶炭疽病的影響。

1 材料與方法

1.1 供試菌株及其培養

1.1.1 供試菌株 枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）Y13，由中南林業科技大學教育部經濟林培育與保護實驗室提供。

1.1.2 供試培養基 NA培養基：牛肉膏1.2 g，蛋白胨4.0 g，NaCl 2 g，瓊脂20 g，水1 000 mL；Y13最大抑菌活性培養基：葡萄糖25 g，酵母膏10g，牛肉膏 28g，NaCl 1.2%，水1 000 mL；Y13最大生長量培養基：葡萄糖25 g，酵母膏10 g，牛肉膏3 g，NaCl 1.5%，水1 000 mL。

1.1.3 拮抗菌Y13施用原液的配置 Y13用NA培養基將菌種活化后，采用Y13最大抑菌活性培養基做一級種子發酵液，再用Y13最大生長量培養基做二級種子發酵液，之后繼續擴繁。平板對峙實驗抑菌率達到88%。亞甲基藍（國產生物染色劑）染色后，用血小板計數法測量原液中孢子數量，目測顯微鏡視野中80 ~ 100個孢子，基本達到1010cfu/mL，其它濃度按相應比例用無菌水稀釋10倍，100倍備用。

1.1.4 Y13噴施菌劑抑菌率測定 將配好的噴施液于備用的炭疽病病原菌做平板對峙實驗，測定抑菌圈的大小，得出抑菌率達到84%。

1.2 試驗處理

1.2.1 濃度試驗處理 研究在浙江省松陽縣象溪鎮下了兒村（28°45′ N，119°48′ E）設置不同濃度Y13防控試驗。該地海拔430 m，位于南坡，坡度30°，油茶林齡30 ~ 40 a，往年有油茶炭疽病發生。試驗隨機設3個處理1個對照，每處理面積20 m×20 m，中間設置隔離帶2 m。每個處理噴施不同濃度的Y13原液，分別為A1（噴施108cfu/mL)，A2（噴施109cfu/mL），A3（噴施1010cfu/mL），ck（清水對照）。每個處理重復3次。根據處理濃度，將配置好的Y13原液用農用型噴霧器噴灑整株油茶至葉片滴水。4月和6月各噴施一次，每次噴施后，間隔25 d再噴一次進行藥效加強。其他撫育措施均按常規處理。

1.2.2 時間試驗處理 研究在浙江省遂昌縣三仁鄉排前村（28°43′ N，119°63′ E）設置不同時間Y13防控試驗，該地海拔396 m，位于南坡，坡度33°，油茶林齡30 ~ 40 a，往年有油茶炭疽病發生。試驗隨機設3個處理1個對照，每處理面積20 m×20 m，中間設置隔離帶2 m，四角定樁用紅繩圈定。每個處理在不同時間噴施1010cfu/mL濃度的Y13原液。分別為分別B1（4月下旬噴施），B2（6月下旬噴施），B3（4月下旬和6月下旬各噴施1次），ck（清水對照）。每個處理重復3次。根據處理時間，將配置好的1010cfu/mL的Y13原液用農用型噴霧器噴灑整株油茶至葉片滴水。每次噴施后，間隔25 d再噴1次進行藥效加強。其他撫育措施均按常規處理。

1.3 生物防效調查

1.3.1 采樣調查 于10月中旬每個樣方對角線隨機選取3株油茶樹，每株樹東南西北隨機抽取15 ~ 20 cm的新抽枝條，收集所有油茶葉片。

1.3.2 防治效果測定方法 采集葉片后，用MRS-9600TFU2L Scan Maker進行掃描，對已收集的數據選用DTOPSIS法綜合評價實驗油茶的病情指數[3]。根據林業行業對于植株防治效果的測定標準，計算防治效果，防效 =（對照病情指數－處理病情指數）/對照病情指數×100%。

1.3.3 病害嚴重度的測量 對已收集的數據采用 LA-S系列植物圖像分析儀系統統計葉片總面積和葉片病斑面積。病害嚴重度為（發病葉片病斑總面積/發病葉片總面積）×100%

1.3.4 新葉生長量的測量 經分析儀系統將采集到的新葉片面積計算加和。

1.4 數據處理

大數據將人與物、物與物關聯，新技術則給內容提供更優勢的供給，運用AR（Augmented Reality ）增強現實技術可以將傳統的方言傳播轉化為參與式傳播與沉浸式傳播，用戶以方言文化作為共同屬性出發，建立共有社交情景，在人與信息之間進行價值轉換，直至形成關系閉環。因此，結合大數據和以AR為代表的前沿技術可分析得出方言傳播機制漸進層次（見圖1），為方言傳播拓展新維度、提出新范式提供有效依據。

以防治效果、病害嚴重度以及植株新葉生長量作為指標，采用Microsoft Excel 2003整理，用SPSS19.0軟件進行一般線性模型單因素處理，方差分析采用單因素新復極差法進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 不同濃度Y13對油茶成林炭疽病的防控效果

由表1可知，在防治效果這一檢驗指標中，3個濃度在P = 0.01水平呈極顯著差異。3種噴施濃度都對油茶成林炭疽病起到了明顯的抑制作用，且防治效果隨濃度的升高而逐漸增加。當濃度為1010cfu/mL時，防治效果達到最高，均值為56.21%。

表1 不同濃度Y13對油茶成林炭疽病的防控效果比較

以病害嚴重度作為指標，3個濃度在P = 0.01水平中A3與A1、A2呈極顯著差異，A1與A2無差異。不同施用濃度的處理均對油茶成林炭疽病起到了一定的抑制作用。濃度越高，病害的嚴重度越低。當濃度為1010cfu/mL時，嚴重度達到最低，均值為34%。而A1、A2與ck并不存在差異，說明108、109cfu/mL這2種濃度并未對炭疽病的嚴重度起到太大的效果，可能是由于濃度較低的Y13不利于微生物的定殖，因此沒有發揮其拮抗的抑制作用。

以新葉生長量為檢驗指標，3個濃度在P = 0.01水平A1、A2與A3呈極顯著差異，A1、A2、CK無差異。總體來看濃度越高，新葉總面積越大。當濃度為1010cfu/mL時，新葉總面積達到最高。由此說明高濃度的枯草芽孢桿菌對植物的生長有一定的影響能力。

綜上所述，3個指標結果一致，1010cfu/mL這一濃度對Y13防治油茶成林炭疽病起到了較好的防治效果。

2.2 不同的施用時間Y13對油茶成林炭疽病的影響

表2 不同的施用時間Y13防治油茶炭疽病效果比較

以病害嚴重度作為指標顯示，在不同時間施用1010cfu/mL的Y13對炭疽病嚴重度的影響在P = 0.05水平存在顯著差異，3個時間水平中B3與B2、B1達到顯著差異，B1與B2、ck間無差異。說明兩月共同施用的效果明顯好于單月噴施，能夠使炭疽病的嚴重度降低。而4月施用與對照相比，嚴重度降低的最少。在P = 0.01水平下，3個時間無差異。

新葉生長量這一檢驗指標中顯示，在P = 0.05水平B1、B2、CK與B3存在顯著差異（Sig = 0.046＜0.05），而P = 0.01無顯著差異。說明單月施用Y13對油茶生長狀況的影響并不是很大。這可能是由于雙月施用能夠使枯草芽孢桿菌的定殖能力增強，從而有效的在油茶葉片上繁殖。

綜上所述，3個檢驗指標結果一致，5月和7月是油茶炭疽病爆發的高峰期，在兩次爆發前都使用生防菌，總體效果要優于單次使用。

3 討論

枯草芽孢桿菌在自然界中廣泛存在，對人畜無毒無害，不污染環境，能產生多種抗菌素和酶，具有廣譜抗菌活性和極強的抗逆能力[6]。Y13是油茶內生拮抗細菌，實驗室盆栽防治油茶炭疽病有很好的效果，也具有一定的廣譜性[5]。本實驗設計了兩個單因素的林間成林實驗，目的是要探求該拮抗菌在自然微生態環境下，對于發病嚴重老林的生物防治效果。

生物均具有一定的生態適應性。在一定生態系中引入生防菌，它能否適應其被引入的生態環境，能否在病菌的寄主植物上定殖、增殖以及與相應病原物競爭決定著生物防治的成敗，這些都與生防菌的定殖和生物學特性緊密相關[7]。由于油茶苗木的葉片和油茶成林葉片的微生態環境不同，可能會造成Y13定殖、抑菌過程的不同，因此反應出的效果也不同。

施用濃度和施用時間是病害生物防治的兩個關鍵因素，由上述結果反應，兩個因素對Y13防治油茶炭疽病的生物效果各自表現出不同的差異。當Y13濃度達到 1010cfu/mL時，防治效果最高，炭疽病的嚴重度最低，葉片生長量最高。4月和6月組合施用也使生防效果達到最優。時間因素并未在葉片生長量這一指標表現差異，可能是與枯草芽孢桿菌的定殖能力有關。生防枯草芽孢桿菌能促進植物根系及植株生長，增強了植物的抗病性,從而間接地減少病害發生[8]。由于本試驗選擇的樣地是油茶老林，其微生物種群相對很豐富，有可能阻礙Y13的定殖能力，因此并未在葉片生長表現作用。

據報道，在國外Selim Dedej為了達到良好的防治效果，還經常利用授粉昆蟲傳播生物農藥，經過3 a田間試驗，利用蜜蜂傳播Serenade粉劑防治美國越橘病害和進行授粉達到兩重功效，取得了不錯的生物防治效果[9]。因此繼續探索生防因子是否適應并在自然微生態環境下發揮其拮抗與抑制病害的作用仍然需要我們研究。

本人認為該次實驗能夠脫離實驗室，可以在復雜的自然環境下測試Y13防治油茶成林炭疽病的生物防控能力，能夠為Y13生物菌劑繼續走向產業化提供一些證實和依據。

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Experiment on Prevention and Control of Anthracnose in Adult Camellia oleifera Stand by Y13

GAO Yue-ting1，ZHOU Guo-ying1*，HE Xiao-yong2，WANG Ming-yue3
（1. Key Laboratory of the Ministry of Education for Economic Forestry Cultivation and Protection, Central South University of Forestry &Technology, Changsha 410004, China; 2. The Graduate Workstation of Lishui Acadmy of Forestry, Lishui 323000, China; 3. Lishui Forest Pest Control and Quarantine Station , Lishui, 323000, China）

Experiment of stands in Songyang and Suichang of Zhejiang tow single factor on prevention and control of Antagonistic endophytic Bacteria Y13 to anthracnose were conducted at adult Camellia oleifera. The results showed that this two single factors played a good role on bio-control of anthracnose. When the concentration up to 1010cfu/mL, Y13 showed the best control effect. And spraying in April and June showed the same bio-control effect. The experiment resulted that high concentration and were the impact bio-control factors.

anthracnose; endophytic antagonist bacteria; biological control; impact factors

S763.1

A

1001-3776（2014）02-0014-04

2013-09-09；

2014-02-18

高月庭（1986－），女，河北張家口人，碩士生，從事森林保護應用微生物研究；*通訊作者。