甘草黃酮對2型糖尿病大鼠肝臟中GSK-3β蛋白表達的影響

金 鑫，趙海燕，馬永平

北方民族大學生物科學與工程學院，銀川750021

糖原合成酶激酶-3(Glycogen synthase kinase-3，GSK-3)是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。該激酶的兩種異構體GSK-3α和GSK-3β均在人類的外周胰島素敏感組織中表達。在靜息細胞中，GSK-3是有活性的，可使糖原合成酶(Glycogen synthase，GS)的絲氨酸位點磷酸化，從而抑制GS的活性，減少糖原合成;而胰島素可間接抑制GSK-3的活性，使GS去磷酸化，從而激活 GS，促進糖原合成。研究表明，GSK-3的活性增強或異常高表達可導致嚙齒動物和人類的胰島素抵抗［1，2］。在嚙齒動物肥胖和2型糖尿病(T2DM)模型中，GSK-3抑制劑通過增加糖原合成、抑制肝臟糖異生而減少葡萄糖輸出，從而增強胰島素敏感性并改善血糖水平［3］。因此，GSK-3被認為是治療2型糖尿病新的藥物靶點。

已有研究表明，甘草黃酮(LF)可抑制KK-Ay小鼠的血糖升高和腹部脂肪積累;它對高脂飲食誘導的肥胖C57BL/6J小鼠的腹部脂肪積累和體重增加有明顯的抑制作用，同時可降低血清胰島素和瘦素的含量;LF還可顯著降低高膽固醇患者的甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDLC)，并減少LDL-C的氧化。本實驗室前期研究成果顯示，LF能有效預防大鼠實驗性糖尿病的發生，并可降低糖尿病大鼠的血糖、抑制其脂代謝紊亂、改善胰島素抵抗［4］;本研究采用 Western blotting方法檢測LF對2型糖尿病大鼠肝臟中GSK3β表達量的影響，旨在探索LF改善胰島素抵抗的分子機制。

1 材料與方法

1．1 實驗動物與飼料

清潔級雄性Sprague Dawley(SD)大鼠(40只)由寧夏醫科大學實驗動物中心［合格證號:SCXK(寧)2011-0001］提供，體重180～220 g。飼養于通風良好，相對濕度為50% ～70%，室溫18～22℃環境中，自由進食飲水，12 h光照周期。普通飼料(標粉25%，玉米粉30%，豆粉10%，麩皮20%，魚粉10%，酵母粉2%，食鹽1%，魚肝油1%，維生素添加劑0．5%，微量元素添加劑0．5%)與高脂高糖飼料(普通飼料61%，豬油10%，蔗糖20%，蛋黃粉8%，膽酸鈉1%)均由北京科澳協力飼料有限公司提供。

1．2 試劑

甘草黃酮系以乙醇為提取劑從甘草(Glycyrrhiza uralensis Fischer)根中提取，并經柱層析進行純化;鹽酸吡格列酮片購自杭州中美華東制藥有限公司;鏈脲佐菌素(STZ)購自Sigma公司;碘［125I］胰島素(INS)放射免疫分析試劑盒購自北京科美東雅生物技術有限公司;全蛋白提取試劑盒購自南京凱基生物科技發展有限公司;BCA protein assay kit購自Thermo Scientific公司;兔抗大鼠GSK-3β抗體、GAPDH抗體和辣根過氧化物酶標記的羊抗兔抗體購自Cell Signaling Technology公司。其它試劑均為分析純。

1．3 主要儀器

ONE TOUCH血糖儀由強生(中國)醫療器材有限公司生產;DU-800核酸蛋白檢測儀由Bec km an公司生產;Calibrated Densitometer(GS-800)由Bio-Rad公司生產。

1．4 動物分組與處理

采用高脂高糖飼料喂養結合一次性小劑量腹腔注射STZ的方法建立2型糖尿病(T2DM)實驗大鼠模型［5］。選30只實驗大鼠以高脂高糖飼料喂養6周，空腹12 h，以35 mg/kg的劑量一次性腹腔注射1%STZ(溶解于0．1 mol/L檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖液，pH 4．2)。72 h后尾靜脈采血檢測大鼠空腹血糖(fasting blood glucose，FBG)，穩定在 16．7 mmol/L以上為造模成功。將成模大鼠(27只)隨機分為糖尿病模型組(DM，9只)、甘草黃酮組(LF，9只)和陽性對照組(PC，9只)，繼續以高脂高糖飼料喂養，同時每天分別以溶劑(1，2-丙二醇)、甘草黃酮［300 mg/(kg·d)］和吡格列酮［10 mg/(kg·d)］灌胃。每周稱一次體重，根據體重變化及時調整給藥量［給藥量(mg)=體重(kg)×甘草黃酮或吡格列酮給藥劑量］，持續6周(灌胃過程中LF組和PC組各有1只大鼠死亡)。另選同批大鼠10只作為正常對照組(CON)，以普通飼料喂養，并以溶劑灌胃。

1．5 取樣

實驗大鼠于處死前空腹12 h，禁食不禁水，10%水合氯醛(400 mg/kg)麻醉后迅速將其胸腔打開，心臟取血并分離血清。取部分肝臟用錫箔紙包裹后置于液氮中速凍，-80℃冰箱保存，備用。

1．6 空腹血糖和胰島素檢測

實驗大鼠于處死前空腹12 h，禁食不禁水，尾靜脈采血，檢測各組大鼠FBG。放射免疫法測定空腹血清胰島素(FINS)含量，具體操作按試劑盒說明進行。根據FBG和FINS的測定結果，計算ISI。

ISI=Ln(FBG×FINS)-1

1．7 免疫印跡法(Western-blotting)分析

1．7．1 肝臟總蛋白提取與定量

采用全蛋白提取試劑盒提取肝臟總蛋白，BCA protein assay kit制作蛋白標準曲線，在562 nm下用DU-800測定各樣品吸光值，計算各樣品的蛋白含量。

1．7．2 Western-blotting

精確量取相當于30μg蛋白質的樣品液，與2×上樣緩沖液等體積混合，100℃變性處理3～5 min;SDS-PAGE(7．5%分離膠和5%濃縮膠)分離蛋白質。分離的蛋白質電轉移至PVDF膜。根據預染標準蛋白分子量的位置，將目的蛋白分子量范圍的膜切下，以3%BSA室溫封閉1．5 h。每條膜分別以封閉液配制的兔抗大鼠GSK-3β抗體或GAPDH抗體4℃孵育過夜。PBS-Tween-20洗膜3次，每次10min。加入封閉液配制的二抗(辣根過氧化物酶標記的)，室溫孵育1 h。采用ECL試劑盒顯色并用X射線膠片感光。

1．7．3 圖像掃描及分析

采用Calibrated Densitometer(Bio-RAD，GS800)對膠片進行掃描，用Quality One軟件對目的蛋白條帶進行定量。蛋白相對表達量用(靶蛋白/GAPDH/Standard)的OD值表示。注:1)GAPDH為甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)的英文縮寫，作為內部參照(Internal Control)。該蛋白是由管家基因編碼表達的蛋白(Housekeeping Proteins)，其在各組織和細胞中的表達相對恒定，在Western Blotting實驗中常用來做參照物，以校正上樣過程中存在的實驗誤差，保證實驗結果的準確性;2)Standard為內標，是某只大鼠肝臟的蛋白提取樣品，每塊膠板上都采用相同的內標，以校正不同膠板之間的誤差。

1．8 數據分析

2 實驗結果

2．1 LF對實驗大鼠空腹血糖、胰島素及胰島素敏感指數的影響

LF對實驗大鼠血糖、胰島素及胰島素敏感指數的影響如表1所示。與CON組相比，DM組大鼠的FBG顯著升高(P＜0．01)、ISI顯著下降(P＜0.01)。與DM組相比，LF組和PC組大鼠的FBG顯著降低(P ＜0．01)，ISI顯著升高(P ＜0．01)。各組FINS無顯著差異。

表1 LF對空腹血糖、胰島素和胰島素敏感指數的影響(x±s)Table 1 Effects of LF on levels of FBS，FINS and ISI±s)

表1 LF對空腹血糖、胰島素和胰島素敏感指數的影響(x±s)Table 1 Effects of LF on levels of FBS，FINS and ISI±s)

注:* 與 CON組相比，P ＜0．01;△與DM 組相比，P ＜0．01。Note:*compare with CON，P ＜0．01;△ compare with DM，P ＜0．01．

胰島素敏感指數CON 10 4．54 ±0．55 24．22 ±5．97 －4．67 ±0．30糖尿病模型組 DM 9 22．66 ±4．25* 25．26 ±9．97 －6．22 ±0．51*甘草黃酮組 LF 8 6．17±1．56△ 20．97±8．01 －4．70±0．49△陽性對照組 PC 8 6．09±2．35△ 21．61±10．62 －4．66±0．30 ISI正常對照組組別Group例數n空腹血糖FBG(mmol/L)空腹胰島素FINS(m IU/L)△

2．2 LF對實驗大鼠肝臟組織GSK-3β蛋白表達量的影響

采用Western-blotting方法對實驗大鼠肝臟組織中GSK-3β的蛋白表達量進行檢測，代表性免疫印跡圖如圖1所示。與CON組相比，DM組大鼠肝臟組織中GSK-3β的蛋白表達量顯著升高了86．67%(P＜0．01)。與DM組相比，LF組和PC組大鼠肝臟組織中 GSK-3β的蛋白表達量分別降低了44.64%(P ＜0．05)和 55．36%(P ＜0．05);LF 組與PC組的蛋白表達量沒有顯著差異。

圖1 肝臟組織中GSK-3β蛋白的免疫印跡圖譜Fig.1 Immunoblot of GSK-3βprotein in liver

圖2 各實驗組大鼠肝臟組織中GSK-3β蛋白表達情況±s)Fig.2 The expression of GSK-3β protein in rats’liver of different groupss)

3 討論

本研究采用Western Blotting方法，定量分析了甘草黃酮對糖尿病大鼠肝臟組織中GSK-3β蛋白表達的影響。研究結果表明，LF可顯著降低糖尿病大鼠肝臟組織中GSK-3β蛋白的表達量，這是首例關于LF影響胰島素信號分子蛋白表達的報道。

胰島素對葡萄糖利用的促進作用包括刺激葡萄糖向其靶細胞內的轉運和增強糖原合成兩個生理過程，這兩個過程均是胰島素信號轉導的結果。胰島素信號轉導的任何環節出現障礙，均會導致胰島素抵抗，進而導致T2DM的發生與發展。GSK-3β在胰島素信號轉導中起著負調節作用，其活性增強或異常高表達可導致嚙齒動物和人類的胰島素抵抗［1，2］。研究表明［6，7］，肌肉中胰島素調節葡萄糖利用的主要環節是葡萄糖轉運;而在肝臟中，葡萄糖轉運不是限速步驟。GSK-3抑制劑 CHIR98023和CHIR99021可顯著提高Zucker糖尿病肥胖(fa/fa)大鼠對葡萄糖的利用，主要是通過增強胰島素刺激的肝臟組織的糖原合成，而對肌肉組織的葡萄糖轉運和糖原合成無影響［8］。上述結果提示，肝臟中GSK-3的抑制是促進機體對葡萄糖的利用和改善胰島素抵抗的主要靶點。本研究中LF顯著降低了DM組大鼠肝臟組織中GSK-3β蛋白的表達量，表明LF可能通過下調GSK-3β的表達增強肝臟組織的糖原合成，從而改善糖尿病大鼠的胰島素抵抗。

許多用于治療糖尿病的胰島素增敏劑，如噻唑烷二酮(thiazolidinedione，TZD)類中的 troglitazone(曲格列酮)、pioglitazone(匹格列酮)和rosiglitazone(羅格列酮)都是PPAR-γ的激活劑［9］。已有研究證實，某些甘草黃酮組分具有 PPAR-γ配體結合活性［10］，提示這些組分可能是 TZD藥物的結構類似物。本研究采用吡格列酮作為陽性對照，它對GSK-3β蛋白表達的下調程度與LF的作用相當，提示LF與吡格列酮對該蛋白表達的調節作用類似。

綜上所述，甘草黃酮能顯著降低2型糖尿病大鼠肝臟中GSK-3β的蛋白表達量，這可能是其改善胰島素抵抗的分子機制之一。

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