樹脂法提取純化白藜蘆醇的新工藝研究

徐月燦，馬德新

湖南希爾天然藥業有限公司，永州425000

白藜蘆醇(resveratrol，Res．)，化學名稱為 3，4'，5-三羥基-二苯乙烯(3，4'，5-trihydroxystilbene)。其別名為虎杖甙元，又稱芪三酚，分子式為C14H12O3，其相對分子質量為228．25，純品為無色針狀結晶，熔點為256～258℃，在261℃以上易升華。其藥理作用為:抗菌、抗氧化、預防心臟病、抗癌、抗血小板凝聚、保護肝臟、雌激素作用、防輻射、免疫調節、抗艾滋病活性等［1］。目前，白藜蘆醇的市場競爭非常激烈，提取純化白藜蘆醇的方法很多，但都采用先酶解再有機溶劑萃取或者柱層析提純工藝［2，3］，生產成本高，產品收率低，不適用于工業化大生產。為了解決提取白藜蘆醇工藝中存在的上述問題，提高市場的競爭力，該文采用樹脂［4］法從虎杖中提取高含量的白藜蘆醇，工藝簡單，生產周期短，生產成本低，更適合于工業化大生產。

1 材料與儀器

1．1 實驗材料

虎杖原藥材購自湖北恩施;白藜蘆醇對照品購自中國藥品生物制品檢定所;各種大孔樹脂購自西安藍曉科技有限公司;釀酒曲購自安琪酵母股份有限公司;其余試劑均為分析純。

1．2 實驗儀器

玻璃樹脂柱尺寸:20 mm×420 mm(自制);安捷倫高效液相色譜儀(HPLC，美國安捷倫公司);N-1001旋轉蒸發儀(上海愛郎儀器儀器有限公司);真空干燥箱(上海新苗醫療器械制造有限公司);四孔水浴鍋(金壇市大地自動化儀器廠);AG135分析電子天平(梅特勒托利多儀器有限公司)。

2 實驗方法

2．1 白藜蘆醇的提取純化

取200 g原料粗粉，加入1 g釀酒曲，再加入750 mL水充分搖勻，置于35～40℃水浴中浸泡過夜，接近24 h后，將水酶解液放下來，然后將藥渣加75%乙醇回流提取，提取三次，每次1 h，合并三次提取液，經回收乙醇，濃縮至500 mL，離心過濾后，濾液上已處理好的XC-7大孔樹脂柱，柱體積100 mL，上完藥液后，用3倍量樹脂體積的10%乙醇洗脫，最后用5倍量樹脂體積的60%乙醇洗脫，收集60%乙醇洗脫液，經回收乙醇減壓濃縮至稠膏，真空干燥即得產品。

2．2 HPLC檢測白藜蘆醇含量

2．2．1 色譜條件

色譜柱為ODSC18柱;流動相為乙腈-水(25∶75)，流速1．0 mL/min，檢測波長307 nm，進樣量為10μL。

2．2．2 系統適用性實驗

分別取對照品溶液、供試品溶液，按上述色譜條件分別進樣，如圖1，理論板數按白藜蘆醇峰計不低于3000。

圖1 白藜蘆醇標準品(A)及白藜蘆醇樣品(B)的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of resveratrol standard(A)and resveratrol sample(B)

2．2．3 線性關系考察

精密吸取上述對照品溶液2、4、6、8和10μL，注入液相色譜儀。按上述色譜條件測定，以對照品峰面積Y為縱坐標，以對照品進樣量X為橫坐標，繪制標準曲線，得回歸方程y=238722x－4597，r=0．9997。線性范圍為白藜蘆醇0．03 ～0．15 μg。

2．2．4 精密度實驗

精密吸取對照品溶液，按上述色譜條件，同法連續測定6次，測得白藜蘆醇峰面積的RSD為0．94%(n=6)，表明儀器精密度良好。

2．2．5 穩定性實驗

取同一白藜蘆醇供試品溶液，按上述檢測條件，分別于0、4、8和12 h時間間隔進行測定，分別測定峰面積，計算得白藜蘆醇峰面積的RSD為1．12%，結果表明供試品溶液在12 h內穩定。

2．2．6 加樣回收率實驗

分別稱取已知白藜蘆醇含量的供試樣品共6份，照供試品溶液制備，分別加入白藜蘆醇對照品溶液4 mL，測定結果平均回收率為101．23%，RSD為1．15%(n=6)。

2．2．7 重復性實驗

取同一批次的虎杖原藥材粗粉，分為5份，按2．1項下方法制備供試品溶液共5份，并在上述色譜條件下進行測定，測定結果為樣品中白藜蘆醇含量平均值為85%，RSD為0．95%，結果表明方法重復性較好。

2．2．8 對照品溶液的制備

取白藜蘆醇對照品適量，精密稱定，加稀乙醇制成每1 mL含15μg的溶液，即得。

2．2．9 供試品溶液的制備

精密稱取按2．1方法試驗下來的產品5 mg，精密加入稀乙醇50 mL，超聲溶解，濾過，取續濾液，即得。

2．2．10 樣品測定

分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測定，即得。

3 結果與討論

3．1 酶解物的選擇

不同酶解物對虎杖原藥材進行對比酶解實驗，結果表明，在24 h內酶解最完全的為釀酒曲，見表1。

3．2 純化白藜蘆醇的不同樹脂實驗

不同樹脂對虎杖提取藥液中白藜蘆醇的除雜純化比較，結果表明，XC-7大孔吸附樹脂對白藜蘆醇純化最好，純化的白藜蘆醇含量遠遠超過其它樹脂的純化結果。結果見表2。

3．3 XC-7大孔樹脂對白藜蘆醇的動態吸附

準確量取 XC-7大孔樹脂100 mL，濕法裝柱(φ2 cm ×50 cm)，用95%乙醇浸泡24 h，并加水淋洗至無醇味。將白藜蘆醇質量濃度為4．48 mg/mL的樣液，以10 mL/min上樣，同時控制洗脫液體積流量10 mL/min，每100 mL接一管，進行HPLC法檢測，結果見圖2。當上樣量達到800 mL時，流出液中白藜蘆醇的質量濃度與樣液中的一致，表明此大孔樹脂的吸附已經達到飽和。計算得出此大孔樹脂對白藜蘆醇的動態吸附量為22．4 mg/mL濕樹脂。

表1 不同酶解物酶解情況Table 1 Enzymolysis resultswith different enzyme substrate used

表2 不同樹脂對白藜蘆醇純化結果Table 2 Resveratrol purification resultswith different resins

圖2 XC-7大孔樹脂對白藜蘆醇的動態吸附曲線Fig.2 Dynamic adsorption curve of resveratrol on XC-7 macroporous resin

3．4 白藜蘆醇的洗脫

為研究乙醇對白藜蘆醇的洗脫性能，取白藜蘆醇質量濃度為4．48 mg/mL的提取液500 mL進行大孔樹脂分離，樹脂柱規格同3．3項下的。分別用10%、30%、50%、60%、70%乙醇各3BV洗脫，洗脫流速為10 mL/min，每100 mL接一管，進行 HPLC法檢測，結果見圖3。300～600 mL洗脫液為30%乙醇，600～900 mL洗脫液為50%乙醇，900～1200 mL洗脫液為60%乙醇，可見白藜蘆醇主要被30%～60%乙醇洗脫。

圖3 乙醇對XC-7大孔樹脂上的白藜蘆醇洗脫Fig.3 Elution of resveratrolon XC-7macroporous resin with ethanol

4 結論

先將原藥材酶解，再利用樹脂對白藜蘆醇的吸附，只需簡單設備幾步就可以將白藜蘆醇含量提高到85%以上，與傳統的萃取重結晶純化工藝相比，該法具有有工藝簡單易行，操作安全方便，產品收率高，生產成本低的特點。

樹脂法從虎杖中提取高含量白藜蘆醇的最佳工藝:用釀酒曲于35～40℃將原藥材先酶解24 h，再用75%乙醇提取，提取液經回收乙醇后上XC-7大孔樹脂柱，先加10%乙醇洗脫，然后再用60%乙醇洗脫并收集洗脫液，濃縮，真空干燥即可，產品中白藜蘆醇含量達85%，白藜蘆醇轉化率達85%以上。

1 Zeng CZ(曾超珍)，Liu ZX(劉志祥)，Wu YH(吳耀輝)，et al．Research developments in extraction technology and determination of resveratrol from Polygonum cuspidatum．Lishizhen Med Mater Med Res(時珍國醫國藥)，2007，18:2992-2993．

2 Deng MR(鄧夢茹)，Liu S(劉韶)，Zhu ZJ(朱周覲)．Optimization of resveratrol from Polygonum cuspidatum by enzyme-assisted extraction．Central South Pharm(中南藥學)，2011，9:699-672．

3 Xing H(邢花)，Tan Q(譚琴)．Development research in resveratrol extraction and purification and its biological activity．Culinary Sci JYangzhou Univ(揚州大學烹飪學報)，2011，28(2):57-60．

4 Wang H(王輝)，Dong RS(董悅生)，Qin JQ(秦建全)，et al．Isolation and purification of resveratrol from fermentation broth of Polygonum cuspidatum．Chin Tradit Herb Drugs(中草藥)，2010，41:223-227．