微藻生物質產品和生物活性物質的研究與開發(fā)

夏 嵩，萬凌琳，李愛芬，張成武

暨南大學水生生物研究中心，廣州510632

微藻生物技術成為近年來一個熱門的研究領域，利用微藻生產高附加值產品在食品、化妝品、醫(yī)藥及水產養(yǎng)殖等領域具有巨大的潛力［1，2］。人類食用微藻的歷史悠久，念珠藻(Nostoc sp．)、鈍頂和極大節(jié)旋藻(Arthrospira platensis＆A．maxima)和水華束絲藻(Aphanizomenon flos-aquae)都被作為食物的來源［2，3］。微藻在醫(yī)療保健上的應用也很廣泛，從微藻中提取的活性物質具有抗腫瘤、抗炎及抗艾滋病毒(HIV)感染等諸多功能［4-6］。本文對微藻用于生物質產品及活性物質生產的研究成果做系統(tǒng)概述，為開發(fā)和利用該資源提供科學依據。

1 微藻生物質及其應用

微藻作為一種光合自養(yǎng)型生物，其所含的葉綠素和類胡蘿卜素可用于食品及化妝品領域。微藻中合成的多種生物活性物質，如抗氧化物質、抗生素及毒素等，可用于制藥工業(yè)。微藻還含有其它豐富的營養(yǎng)成分，如蛋白質、維生素和多糖等，可作為食品添加劑和水產飼料等。同時，某些微藻還含有大量的油脂或淀粉，可用于生物燃料的生產。微藻的商業(yè)應用已經在不同的領域有所發(fā)展(表1)。

1．1 保健食品

微藻的產品形式主要包括噴霧干燥的藻粉、片劑和膠囊，其中應用最廣的包括小球藻(Chlorella vulgaris)和節(jié)旋藻)(A．platensis ＆ A．maxima)［9］。小球藻作為一種保健食品和膳食補充劑，對胃潰瘍、創(chuàng)傷、便秘、動脈粥樣硬化、高膽固醇及腫瘤方面具有積極功效［4］。小球藻細胞中含有 β-1，3-葡聚糖，它是一種免疫刺激劑，在自由基清除、降血脂及抗腫瘤方面具有重要作用［10，11］。普通小球藻還富含蛋白質、8種必須氨基酸、維生素(B-族維生素和抗壞血酸)、礦物質(鉀、鈉、鎂、鈣)、β-胡蘿卜素、葉綠素等，在健康保健方面同樣具有積極作用［12］。

表1 部分商業(yè)化應用微藻的生產廠家和應用領域［7，8］Table 1 Some commercial productionalmicroalgal species and their applications

節(jié)旋藻蛋白(特別是藻膽蛋白)含量高，氨基酸含量可達藻體干重的62%;其細胞壁柔軟，主要由肽聚糖組成，容易消化吸收，因此被廣泛應用于營養(yǎng)品的生產。節(jié)旋藻細胞中所含的藻藍蛋白具有很強的自由基清除能力，是一種潛在的抗腫瘤活性成分。同時，節(jié)旋藻是γ-亞麻酸和B族維生素含量最豐富的藻類之一［13］。γ-亞麻酸是一種必需的多不飽和脂肪酸，在降低血膽固醇過多病人的低密度脂蛋白、緩和經前綜合征和治療異位性濕疹方面具有很好的療效［14］。體外和體內試驗表明γ-亞麻酸能夠特異性殺滅腫瘤細胞，對正常細胞沒用損害作用［15］。γ-亞麻酸在改善精神分裂癥、多發(fā)性硬化癥、皮炎、糖尿病和風濕性關節(jié)炎等疾病方面也具有一定作用［16，17］。由于節(jié)旋藻豐富的營養(yǎng)及醫(yī)療作用，世界衛(wèi)生組織(WHO)把節(jié)旋藻稱為地球上最偉大的超級食物之一，美國宇航局(NASA)也認為它是一種很好的太空旅行壓縮食品［18］。

我國云南省的綠A集團是國內節(jié)旋藻生產規(guī)模最大的企業(yè)，年生產節(jié)旋藻藻粉600多噸，同時還生產節(jié)旋藻的保健食品膠囊和片劑。日本迪愛生(DIC)投資的海南迪愛生微藻有限公司每年生產300噸的節(jié)旋藻干粉。該公司在美國加州南部建立的Earthrise Farms公司，擁有444000平方米的生產廠區(qū)，是世界上最大的節(jié)旋藻生產者之一，產品銷往全世界超過25個國家和地區(qū)［19］。

1．2 動物營養(yǎng)及飼料

除用于人類保健食品外，微藻在魚類、寵物及家畜飼養(yǎng)方面也有廣泛應用。水產養(yǎng)殖用的微藻要易于培養(yǎng)，不含有毒成分，形狀大小適合攝取，細胞壁容易消化，且營養(yǎng)品質高。其中蛋白質含量是決定微藻營養(yǎng)價值的一個主要因素，其次多不飽和脂肪酸含量及維生素含量也是重要的考量因素。海生小球藻(Chlorella marina)、瑞典四爿藻(Tetraselmis suecia)、三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)、綠色巴夫藻(Pavlova lutheri)、擬微綠球藻(Nannochloropsis spp．)、球等鞭金藻(Isochrysis galbana)、牟氏角毛藻(Chaetoceros muelleri)、中肋骨條藻(Skeletonema costatum)和威氏海鏈藻(Thalassiosira weissflogii)都是常用的水產育苗幼體的開口餌料［20］。

微藻還被用于改善水產品的質量。人工餌料(飼料)因為缺少天然色素，所以不能提供某些水產養(yǎng)殖品種的著色及生長調節(jié)的需要，如三文魚和鮭魚的肉質特征顏色。因此一些類胡蘿卜素，如蝦青素(astaxanthin)必須添加到這些貴重水產品的飼料中。實際上日本和加拿大已經允許添加微藻蝦青素來喂養(yǎng)三文魚［21］。法國也通過喂食牡蠣哈氏硅藻(Haslea ostrearia)，使牡蠣的腮和唇瓣帶增加藍綠色，以提高其市場銷量［20］。

2 微藻生物活性成分及其應用

2．1 微藻天然色素

近年來，由于某些化學合成色素存在的毒性問題，天然色素因其安全性高的特點，需求越來越大。2004年全世界對類胡蘿卜素的需求量是6．4億歐元，且以每年2．2%的速度增加。其中β-胡蘿卜素(β-carotene)的需求從2004年的1．75億歐元上升到2009年的1．83億歐元。其它葉黃素類(Xanthophyll)色素，如蝦青素、角黃素(canthaxanthin)和葉黃素(lutein)的需求量也日漸增加。

來源于微藻的類胡蘿卜素種類較多(表2)。其中最常見的就是工業(yè)化培養(yǎng)鹽生杜氏藻(Dunaliella salina)生產的β-胡蘿卜素。鹽生杜氏藻能夠積累大量的β-胡蘿卜素，可達細胞干重的12%。因其能在高鹽、低氮及高光條件下生長，易于在戶外開放池培養(yǎng)。同時相較于化學合成的β-胡蘿卜素(全反式結構)，鹽生杜氏藻合成的β-胡蘿卜素具有全反式和9-順式兩種結構，具有更高的生物利用度、抗氧化特性和生理功能［24］。目前，澳大利亞、以色列、美國和中國有許多工廠利用鹽生杜氏藻生產天然的β-胡蘿卜素，其中主要的生產廠商是澳大利亞的Cognis Nutrition and Health公司。鹽生杜氏藻產品主要分成三部分:β-胡蘿卜素提取物和用于人類健康及動物飼料的藻粉。這些產品的價格在每公斤300～3000 美金之間［2］。

蝦青素是一種非維生素A原的類胡蘿卜素，主要存在于甲殼動物如:蝦、蟹、三文魚，以及某些酵母菌和微藻中。蝦青素色澤艷麗，其抗氧化性能優(yōu)于β-胡蘿卜素、玉米黃素、角黃素、維生素C和維生素E等，可解除光氧化脅迫，抑制光敏作用。試驗證明，蝦青素還具有很強的抗癌作用，降低肝癌和肺腫瘤病灶的數目和大小，對膀胱癌、口腔癌和結腸癌細胞有明顯的抑制作用。另外，蝦青素還具有免疫調節(jié)活性，對抗炎制劑具有增效作用。因此，蝦青素已被廣泛應用于食品、醫(yī)藥、化妝品及飼料和餌料等的生產［21，25］。

表2 部分微藻生產的類胡蘿卜素［22，23］Table 2 Themain carotenoids derived from microalgae

雨生紅球藻(Haematococcus pluvialis)是一種淡水單細胞綠藻，其紅色孢囊中蝦青素的含量超過其總胡蘿卜素的80%，最高含量可達到細胞干重的6%，被公認為自然界中生產天然蝦青素最好的生物［26］。在日本、加拿大和美國雨生紅球藻已被批準用作食品天然著色劑，以及魚類餌料的天然色素添加劑。Aquasearch公司的AstaFactorTM產品于1999年12月被美國FDA批準，允許在美國銷售以作為人類營養(yǎng)保健食品的蝦青素來源，產品的功效定位在強化免疫系統(tǒng)功能、抗癌、保護視網膜免受紫外輻射和光氧化、抗炎、預防血液膽固醇的氧化損傷等方面。Cyanotech公司的雨生紅球藻產品BioAstinTM軟膠囊產品已被美國批準作為人類的營養(yǎng)食品，并在美國和加拿大銷售，主要功能為保護皮膚免受紫外輻射損傷、減輕與年齡相關的黃斑變性、防止化學誘發(fā)的癌癥、增加高密度脂蛋白的產生、強化免疫系統(tǒng)和能量代謝［27］。

葉黃素主要存在于深色綠葉蔬菜如菠菜和甘藍，以及玉米、蛋黃等一些黃色食品中。目前葉黃素主要通過從萬壽菊(Tagetes erecta)的花瓣中提取獲得，但含量低、分離純化難度大、產品純度不高，且95%以上都是酯化的［28］。而微藻中的葉黃素通常以游離的非酯化的形式存在，是一種很好的替代資源。擬穆氏藻(Muriellopsis sp．)能夠積累大量的葉黃素，同時獲得比較高的生物量，具有很好的發(fā)展前景。Del Campo等［29］在戶外55L的管狀光生物反應器中培養(yǎng)擬穆氏藻，在優(yōu)化的條件下整個培養(yǎng)系統(tǒng)可以高效地全年運轉。獲得的最高生物質產率和葉黃素產率分別達到40 gm-2d-1和180 mgm-2d-1。其它微藻如:阿萊梅柵藻(Scenedesmus almeriensis)和原泡囊小球藻(Chlorella protothecoides)也能夠積累葉黃素。西班牙的科研人員在溫室中利用4000L的管式光生物反應器培養(yǎng)阿萊梅柵藻，最大葉黃素產率達到了 290 mgm-2d-1［30］。

巖藻黃素(fucoxanthin)是一種天然的類胡蘿卜素，廣泛存在于硅藻、褐藻、隱藻和甲藻細胞中，其特征是分子中有5，6-單環(huán)氧化鍵和丙二烯鍵(allene，C=C=C)。研究表明，巖藻黃素具有抗氧化活性、抗癌活性、抗炎活性、減肥作用、抑制糖尿病、提高免疫力、護膚增白的效果和抗痤瘡活性［31-33］。巖藻黃素對不同類型的腫瘤細胞株都有抑制作用，并存在劑量關系，但對不同的腫瘤細胞株抑制性是有差異的，能明顯誘導腫瘤細胞出現早期凋亡。相關的研究還發(fā)現巖藻黃素可以通過兩種方式來消除脂肪堆積:通過激活白色脂肪組織(WAT)中線粒體解偶聯蛋白(UCP1)的表達，促進脂肪分解，達到抗肥胖的效果;另外，巖藻黃素能明顯下調各種脂肪生成酶的活性，同時減低脂肪酸β-氧化的活性，并改變血清脂動素(adipokine)水平。巖藻黃素還能明顯減低血液葡萄糖和血漿中胰島素的量，同時能明顯地提高肝臟中二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid，DHA)的水平。因此，巖藻黃素對代謝綜合癥有明顯的保護作用。

角黃素存在于藻類、細菌和甲殼動物中，同時通過捕食在魚類體細胞中積累。研究表明角黃素比蝦青素更能有效地在鮭魚細胞中沉積，因此在英國、加拿大及智利等國家，角黃素已經廣泛應用于鮭魚飼料的色素添加劑中。角黃素還被應用于家禽飼料添加劑中，通過添加角黃素到肉雞飼料中，增加了受精率和孵化率，降低了雞蛋中的硫代巴比妥酸反應產物［34］。角黃素在體外抗氧化、膜模型系統(tǒng)、脂質體和分離的鼠肝臟細胞中都表現出很強的抗氧化能力;同時角黃素還具有抗衰老、抗紫外輻射和抗腫瘤等作用;因其能在表皮下脂肪層沉積，使皮膚呈現太陽曬過后的橙色，角黃素還應用于仿曬產品中［35，36］。但大量研究表明角黃素對人體健康存在負面影響，主要表現在引起視網膜黃色晶斑沉積上，這主要由于角黃素分子和脂類的酰基鏈之間有較強的范德華作用、對脂分子的節(jié)段分子運動的限制、對脂膜的表面修飾以及基于氫鍵形成的相互作用等［37］。

堇菜黃素(Violaxanthin)存在于深色綠葉蔬菜中。有研究表明雍菜(Ipomoea aquatica)中的堇菜黃素在ABTS自由基的清除、抑制紅細胞溶血及肝臟脂質過氧化方面的活性高于葉黃素和β-胡蘿卜素［38］。目前也有少量文獻報道微藻中堇菜黃素的生理活性研究。Pasquet等［39］發(fā)現從杜氏藻(Dunaliella tertiolecta)中提取的堇菜黃素具有很強的抗腫瘤細胞增殖作用，在0．1～40μgmL-1都能抑制人類乳腺癌細胞系MCF-7增殖，并存在劑量關系，同時會引起腫瘤細胞凋亡。Soontornchaiboon等［40］研究了橢圓小球藻(Chlorella ellipsoidea)中堇菜黃素的抗炎癥活性，結果表明堇菜黃素明顯抑制脂多糖刺激的RAW 264．7小鼠巨噬細胞中一氧化氮合成酶(iNOS)和環(huán)氧酶(COX-2)的表達，從而降低了一氧化氮(NO)和前列腺素E2(PGE2)的產生;同時堇菜黃素對核因子-κB(NF-κB)p65亞基易位到細胞核的抑制作用，表明這種抗炎活性的主要機制是抑制NF-κB途徑。

藻膽蛋白(Phycobiliproteins)的主要來源是節(jié)旋藻和紫球藻。研究表明藻膽蛋白除了作為一種天然的食品染色劑以外，在健康保健品及醫(yī)藥品生產方面也有重要作用。日本的Dainippon Ink and Chemicals公司推出了一種叫做Lina blue的產品，用于口香糖、果汁、雪糕、糖果、乳制品及芥末醬等食品中。他們也銷售由這種色素生產的口紅和眼線膏等化妝品［41］。另外，因其高摩爾吸光系數、高熒光量子產率、低聚物穩(wěn)定性及高耐光性等特性，藻膽蛋白也應用于臨床及免疫學研究中，用作抗體標簽、免疫標記、熒光顯微鏡及熒光診斷等［42］。

圖1 部分微藻的類胡蘿卜素化學結構式Fig.1 Chemical structure of carotenoids in somemicroalgae．

圖1顯示的是部分微藻的類胡蘿卜素化學結構。已知的超過600種類胡蘿卜素化學結構都是由40個碳構成的多烯鏈骨架組成。這種多烯系統(tǒng)使得這些類胡蘿卜素具有獨特的分子結構、化學特征和捕光特性。鏈的末尾可以連接環(huán)狀基團和添加某些含氧的功能基團。同時氧可以以環(huán)氧基(如角黃素)、羥基存在(如葉黃素)或者兩者都有(如蝦青素)，也可以以酮基的形式存在。這些類胡蘿卜素結構的差異性也是藻種生理功能差異的重要原因之一［43］。

2．2 長鏈多不飽和脂肪酸

多不飽和脂肪酸對人類代謝具有重要作用，它是細胞膜磷脂的主要成分同時也會儲存在細胞油體中。其中最重要的ω3系列的長鏈多不飽和脂肪酸是二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid，EPA)和DHA。EPA被譽為“血管清道夫”，功能相當于深海魚油的六倍。具有防止人體代謝失調，血管硬化和心臟血管栓塞，降低高血壓和膽固醇，抑制血小板凝結等作用。適用于各種心腦血管疾病以及風濕性關節(jié)炎、氣喘和糖尿病等［44］。DHA對人體健康也具有諸多益處，如抵抗癌癥、艾滋病、心臟病以及降低膽固醇和增強免疫力等。DHA是神經系統(tǒng)細胞生長及維持的一種主要元素，也是大腦和視網膜的重要構成成分。因此，對胎嬰兒智力和視力發(fā)育至關重要。許多機構建議嬰兒配方奶粉中添加DHA［2］。

人類及動物缺乏合成超過18個碳原子的多不飽和脂肪酸所必需的酶，因此必須從食物中獲得。目前多不飽和脂肪酸主要來源于魚油，但由于魚類資源有限且魚油具有魚腥味、氧化穩(wěn)定性低及毒素積累高，需要尋找新的替代資源。微藻是海洋中主要的初級生產者，許多微藻能夠合成積累多種長鏈多不飽和脂肪酸，通過純化后可用作高價值的食品添加劑。Hu等［45］和 Zhang等［46］研究了綠色巴夫藻和擬微綠球藻中EPA的積累規(guī)律，同時對影響其積累的環(huán)境條件進行評估。Vazhappilly和Chen［47］發(fā)現寇氏隱甲藻(Crypthecodinium cohnii)的DHA含量可達到總脂肪酸的30% ～50%，遠高于強壯前溝藻(Amphidium caryerea)和金色破囊壺藻(Thraustochytrium aureum)細胞中的DHA含量。其它微藻，如紅樹裂壺藻(Schizochytrium mangrove)中DHA含量也高達總脂肪酸的33% ～39%［48］。

通過異養(yǎng)培養(yǎng)寇氏隱甲藻生產DHA，是目前從藻類中商業(yè)化生產DHA的唯一途徑。Martek公司利用寇氏隱甲藻(Crypthecodinium cohnii)生產DHA，用于嬰兒配方奶粉中。OmegaTech公司以及Nutrinova公司，分別利用裂壺藻和吾肯氏壺藻(Ulkenia sp．)生產 DHA，用于成人膳食補充劑［2，4］。也有一些研究旨在從微藻中生產ω6系列的多不飽和脂肪酸，如利用節(jié)旋藻中生產γ-亞麻酸(18∶3)以及利用紫球藻(Porphyridium spp)和缺刻緣綠藻(Parietochloris incisa)生產花生四烯酸(20∶4，arachidonic acid，ARA)［2，6］。

2．3 生物活性多糖

微藻光合作用所形成的儲藏性碳水化合物分為淀粉、紅藻淀粉、裸藻淀粉和金藻昆布糖(或昆布糖)。裸藻淀粉、金藻昆布糖和昆布糖是β-1，3葡聚糖(β-1，3-D-glucans)，它是一種結構復雜的葡萄糖多聚復合物，主要由葡萄糖通過β-1，3糖苷鍵主鏈和少量的β-1，6糖苷鍵支鏈連接而成。在中國和日本，β-1，3葡聚糖已被列為 GRAS(Generally Recognized as Safe，通常認為是安全的)中，可添加于醫(yī)藥、食品、個人護理品、飼料等行業(yè)。有研究表明，從硅藻尖針桿藻(Synedra acus)中提取的金藻昆布糖具有明顯的抗腫瘤活性［49］。

微藻雜聚硫酸酯多糖，由于其結構和組成的復雜性，從而表現出多種生理功能。它對植物病毒和一些植物病原菌有較強的抗性，對皰疹病毒(Herpes simplex virus types 1 and 2，HSV 1，2)和水痘病毒(Varicella zoster virus，VZV)亦有很強的抗性。另外，能夠明顯地抑制鼠白血病反轉錄病毒(murine leukemia virus-MuLV)的產生和鼠瘤反轉錄病毒(murine sarcoma virus-MuSV-124)的細胞轉化。對出血性敗血病病毒(haemorrhagic speticaemia virus，VHSV)和非洲豬熱病毒(African Swine fever virus，ASFV)有較強的抗性，并具劑量依賴關系。天然的胞外多糖或化學改構的紫球藻胞外多糖對結腸癌和淋巴(腺)瘤有抑制作用，而對正常細胞無毒害對血癌細胞有抑制作用，同時具有免疫調節(jié)活動。化學改構的多糖具有類似于肝素的抗凝活性。多糖還具有抗炎癥和潤膚的作用，被應用于化妝品中［50］。

2．4 穩(wěn)定同位素生化成分

微藻是一種理想的制備穩(wěn)定同位素標記成分的資源。微藻可以通過光合作用從相對廉價的無機分子(13CO2、15NO3和2H2O)中吸收穩(wěn)定同位素，合成價值更高的有機組分(如氨基酸、碳水化合物、脂類及核酸等)。穩(wěn)定同位素生化成分可用于原子水平大分子的結構分析和代謝流的研究［51］。對這些化合物的市場需求超過1300萬美金。美國劍橋同位素實驗室(Cambridge Isotope Laboratories)的光譜穩(wěn)定同位素(Spectra Stable Isotopes)，以5900和28000美金/克的價格銷售標記的氨基酸和核酸［2，4］。

2．5 毒素

部分甲藻和硅藻會產生毒素，例如亞歷山大藻(Alexandrium sp．)和短凱倫藻(Karenia brevis)產生麻痹性貝類毒素和短裸甲藻毒素B，引起神經系統(tǒng)中毒［52］。除此之外，克雷前溝藻(Amphidinium klebii)會產生多種大環(huán)內酯類毒素如amphidinol-7，對L1210細胞具有極強的細胞毒性［53］。利馬原甲藻(Prorocentrum lima)和鰭藻(Dinophysis sp．)合成的岡田酸(okadaic acid)，是一種蛋白去磷酸化抑制劑［54］。毒剛比亞藻(Gambierdiscus toxicus)產生的西加毒素(ciguatoxin)和刺尾魚毒素(maitotoxin)會引起腹瀉，同時它產生的剛比亞酸(gambieric acid)是很好的真菌生長抑制劑［74］。某些硅藻合成的軟骨藻酸(domoic acid)，是一種神經刺激谷氨酸受體的三羧酸拮抗劑，同時具有很好的驅除蛔蟲和蟯蟲的功效［55］。

3 結論

目前，微藻在人類及動物營養(yǎng)、化妝品及高附加值產品(如色素、脂肪酸及穩(wěn)定同位素等)生產上有許多應用，但微藻生物技術仍處在起步階段。自然界的微藻種類超過10000種，僅有幾百種用于生化組成的研究，用于大規(guī)模工業(yè)化培養(yǎng)的則更少。因此，藻種的分類和篩選是未來微藻生物技術發(fā)展的基礎，其中藻株的基因改良是一種重要的工程手段。微藻在工業(yè)反應器中低效的生長表現是限制微藻生物技術發(fā)展的主要障礙之一，建立更加高效、經濟的微藻培養(yǎng)體系是未來的發(fā)展方向之一。同時，微藻在農業(yè)及水環(huán)境治理領域，如廢水處理、微藻固氮及土壤修復等方面，也有廣闊的應用前景。

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