不同發(fā)酵原料對(duì)普洱茶抗氧化活性的影響

劉 春，劉 建，龔加順

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南昆明650201)

普洱茶屬黑茶類，原產(chǎn)于我國(guó)云南西雙版納地區(qū)，是以云南特有的大葉茶為原料，經(jīng)殺青、揉捻、日曬等工序制成曬青毛茶，再經(jīng)特殊后發(fā)酵工藝并經(jīng)蒸壓制成的各種規(guī)格的成品茶，因早期集散地在云南普洱縣而得名［1］。普洱茶在發(fā)酵過(guò)程中，發(fā)生轉(zhuǎn)化、酶促及非酶促氧化、降解、縮合等化學(xué)反應(yīng)，形成了非常復(fù)雜的物質(zhì)基礎(chǔ)，除含有多酚類、兒茶素類、黃酮類等主要活性成分外，還含有多種生物堿、氨基酸和有機(jī)酸類化合物等成分［2］。普洱茶具有降血脂、減肥［3－4］、抗癌［5］、降壓、防治糖尿病［6］、提高免疫力、抗氧化［7］、生津止渴、醒酒解毒等多種功效［8］。大量研究表明，普洱茶的多種藥理活性均與其抗氧化活性相關(guān)［1］。

本研究以曬青綠茶、半發(fā)酵紅茶和全發(fā)酵紅茶為原料，經(jīng)固態(tài)發(fā)酵制備普洱茶，再以三種普洱茶的水提法提取物作為研究對(duì)象，進(jìn)行還原力、清除DPPH自由基能力、抑制脂質(zhì)體過(guò)氧化活性、清除羥基自由基能力的測(cè)定從而評(píng)價(jià)其抗氧活性。可以為選擇和加工制作具有高抗氧化活性的普洱茶的發(fā)酵原料提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

茶樣 以曬青綠茶、半發(fā)酵紅茶和全發(fā)酵紅茶為原料發(fā)酵普洱茶，昌寧茶廠提供;磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、三氯化鐵、亞硫酸鐵、過(guò)氧化氫 分析純，天津市化學(xué)試劑三廠;DPPH標(biāo)樣 分析純，美國(guó)Sigma公司;甲醇、水楊酸鈉 分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑公司;鐵氰化鉀 分析純，中國(guó)成都化學(xué)試劑廠;三氯乙酸 分析純，前進(jìn)化學(xué)試劑廠;卵磷脂 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;硫代巴比妥酸 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;鹽酸 分析純，重慶川東有限公司;L－抗壞血酸 分析純，中國(guó)南化化學(xué)試劑廠。

電子天平 感量為0.0001g，沈陽(yáng)龍騰電子有限公司;水浴鍋 HH－60，常州市普達(dá)教學(xué)儀器有限公司;恒溫電熱干燥箱101－3ABS，北京市永光明醫(yī)療儀器廠;海爾冰箱 BCD－208K/A，青島;離心機(jī) 80－1，常州市華普達(dá)教學(xué)儀器有限公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 RE－52A，上海亞榮儀器廠;移液槍 10～100、100～1000μL，大龍醫(yī)療設(shè)備有限公司;真空泵 SHZ－Ⅲ，上海亞榮生化儀器廠;722分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 茶樣的制備

1.2.1.1 曬青綠茶的加工(對(duì)照)鮮葉殺青→揉捻→太陽(yáng)曬干→曬青綠茶。

表1 發(fā)酵前后茶葉樣品的感官變化Table 1 Sensory change of different tea samples before and after fermentation

殺青是為了鈍化酶的活性，曬青茶的湯色青綠明亮，口感強(qiáng)烈。

1.2.1.2 半發(fā)酵紅茶的加工 鮮葉→萎凋(2～3h)→揉捻→發(fā)酵12h→半發(fā)酵紅茶→烘干(65～75℃)→成品。成品湯色黃明亮微紅，滋味濃強(qiáng)，收斂性強(qiáng)。

1.2.1.3 全發(fā)酵紅茶的加工 鮮葉→萎凋(2～3h)→揉捻→發(fā)酵24h→全發(fā)酵紅茶→烘干(65～75℃)→成品。成品湯色紅濃明亮，滋味濃強(qiáng)，鮮爽。

1.2.2 普洱茶的發(fā)酵 稱取曬青綠茶、半發(fā)酵紅茶、全發(fā)酵紅茶各2kg均勻噴灑蒸餾水560g，靜置2h后用透氣性食品薄膜包裹，置于45℃，相對(duì)濕度70%的全自動(dòng)控制發(fā)酵箱中發(fā)酵40d，期間每10d翻一次堆，發(fā)酵結(jié)束后于60℃下鼓風(fēng)干燥，得到不同發(fā)酵程度的普洱茶四翻，即所需茶樣，分別命名為PU－ERH TEA 1、PU－ERH TEA 2、PU－ERH TEA 3。1.2.3 受試樣品的提取

1.2.3.1 普洱茶茶粉的提取流程 100g茶樣加入1kg沸水在75℃恒溫條件下浸提2次→過(guò)濾→濾液→真空濃縮→真空冷凍干燥→茶粉

1.2.3.2 樣品的處理 分別配制 0.02、0.04、0.06、0.08、0.10mg/mL的樣品溶液。

1.2.4 指標(biāo)的測(cè)定方法

1.2.4.1 DPPH自由基清除力的測(cè)定 根據(jù)文獻(xiàn)［9］，參照彭長(zhǎng)連等人的方法測(cè)定。

1.2.4.2 還原力的測(cè)定 根據(jù)文獻(xiàn)［10］參照莫開菊等人的方法測(cè)定。

1.2.4.3 羥基自由基清除率的測(cè)定 根據(jù)文獻(xiàn)［11］，參照李穎暢等人的方法測(cè)定。

1.2.4.4 抑制脂質(zhì)體過(guò)氧化活性的測(cè)定 根據(jù)文獻(xiàn)［12］參照李穎暢等人的方法測(cè)定。

1.2.4.5 不同茶葉樣品的感官評(píng)定 參照GB/T 23776－2009［13］茶葉感官審評(píng)方法(2009)進(jìn)行感官評(píng)定。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 采用SPSS(17.0)統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵前后茶葉樣品的感官變化

從表1中可以看出，發(fā)酵前后，三種普洱茶的感官均發(fā)生了變化，外表顏色和茶湯顏色都加深，與發(fā)酵前相比，在發(fā)酵后都具有陳香，滋味的變化都是苦味加重(全發(fā)酵的除外)，葉底顏色均加深。

2.2 三種普洱茶提取物的DPPH自由基清除效果

2.2.1 不同濃度的普洱茶提取物的DPPH自由基清除率 三種普洱茶茶具有很好的DPPH自由基清除能力(表2)，經(jīng)SPSS統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)同組普洱茶提取物對(duì)DPPH自由基的清除率與濃度呈正相關(guān)，并且兩兩之間均達(dá)到了顯著性差異(p＜0.05)。三種普洱茶對(duì)DPPH自由基清除能力有較大的差異，可以得出三種普洱茶對(duì)DPPH自由基清除能力順序依次為:PUERH TEA 2＞PU－ERH TEA 1＞PU－ERH TEA 3。

表2 不同發(fā)酵原料、不同濃度的普洱茶提取物對(duì)DPPH自由基清除率的影響Table 2 Effect of different fermentation materials，different concentrations of Pu－erh tea extract on DPPH free radical clearance

2.2.2 不同pH的普洱茶提取物的DPPH自由基清除率 不同pH的普洱茶提取物對(duì)DPPH自由基的清除率如表3所示，普洱茶提取物濃度為1mg/mL，DPPH自由基濃度為0.1mg/mL。隨著pH的增大，三種普洱茶提取物對(duì)DPPH自由基的清除率呈下降趨勢(shì)，經(jīng)SPSS統(tǒng)計(jì)分析，兩兩之間均達(dá)到了顯著性差異(p＜0.05)。pH＞8.0后，三種普洱茶提取物對(duì)DPPH自由基清除率急劇下降，其中以半發(fā)酵紅茶為原料的普洱茶提取物受pH影響變化最大。

據(jù)報(bào)道茶多酚有較好的耐酸性，在pH 2～7范圍內(nèi)均十分穩(wěn)定，光照或pH大于8時(shí)易氧化聚合［14］，全發(fā)酵紅茶的重要成分茶黃素較不穩(wěn)定，且在堿性條件及沸水里易降解(常溫及酸性條件下較穩(wěn)定)［15］，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與研究結(jié)果相符。

2.3 普洱茶提取物還原力的測(cè)定

對(duì)不同濃度(0.02、0.04、0.06、0.08、0.10mg/mL)的普洱茶提取物的還原力進(jìn)行研究，結(jié)果如表4所示。SPSS統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)三種普洱茶提取物的還原力均與濃度呈正相關(guān)，并且兩兩之間均達(dá)到了顯著性差異(p＜0.05)，這與DPPH清除率結(jié)果一致。結(jié)果表明，三種普洱茶提取物還原力順序依次為:PU－ERH TEA 2＞PU－ERH TEA 1＞PU－ERH TEA 3。

表3 不同發(fā)酵原料、不同pH的普洱茶提取物對(duì)DPPH自由基清除率的影響Table 3 Effect of different fermentation materials and different pH of Pu－erh tea extract on DPPH free radical clearance

表4 不同發(fā)酵原料、不同濃度的普洱茶提取物的還原力(OD)Table 4 Effect of different fermentation materials，different concentrations of Pu－erh tea extract on reducing power

2.4 三種普洱茶提取物的清除羥基自由基的能力

對(duì)不同濃度(0.02、0.04、0.06、0.08、0.10mg/mL)的茶葉提取物對(duì)羥基自由基的清除率如表5所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著濃度的增加，PU－ERH TEA 1和PU－ERH TEA 3提取物對(duì)羥基自由基的清除率均有不同程度的降低，而PU－ERH TEA 2對(duì)羥基自由基清除率的效果呈不規(guī)則變化。經(jīng)SPSS分析，同組茶葉提取物兩兩之間均有不同程度的顯著性差異(p＜0.05)。從表5可以看出，三種普洱茶提取物對(duì)羥基自由基清除率沒(méi)有得到很好的差異性，總體來(lái)說(shuō)，對(duì)羥基自由基的清除能力大小依次為:PU－ERH TEA 2＞PU－ERH TEA 1＞PU－ERH TEA 3。

表5 不同發(fā)酵原料、不同濃度的普洱茶提取物清除羥基自由基的效果Table 5 Effect of different fermentation materials，different concentrations of Pu－erh tea extract on clear of hydroxyl radicals

2.5 普洱茶提取物脂質(zhì)體過(guò)氧化抑制率的測(cè)定

對(duì)不同濃度(0.02、0.04、0.06、0.08、0.1mg/mL)的茶葉提取物對(duì)脂質(zhì)體過(guò)氧化抑制率如表6所示。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，濃度在0.02～0.04mg/mL范圍內(nèi)，抑制脂質(zhì)體過(guò)氧化能力依次是PU－ERH TEA 1＞PU－ERH TEA 3＞PU－ERH TEA 2;濃度在 0.06～0.10mg/mL范圍內(nèi)，抑制脂質(zhì)體過(guò)氧化能力依次是PU－ERH TEA 3＞PU－ERH TEA 1＞PU－ERH TEA 2;隨著提取物濃度增大，三種茶葉提取物對(duì)脂質(zhì)體抑制率不斷增大，但PU－ERH TEA 2變化較小。

表6 不同發(fā)酵原料、不同濃度的普洱茶提取物的脂質(zhì)體過(guò)氧化抑制率Table 6 Effect of different fermentation materials，different concentrations of Pu－erh tea extract on the liposome raise inhibition rate

3 結(jié)論

以不同濃度、不同原料(曬青綠茶、半發(fā)酵紅茶、全發(fā)酵紅茶)發(fā)酵的普洱茶提取物都具有清除DPPH自由基的能力，其能力順序依次為以半發(fā)酵紅茶發(fā)酵的普洱茶＞以曬青綠茶發(fā)酵的普洱茶＞以全發(fā)酵紅茶發(fā)酵的普洱茶;當(dāng)普洱茶提取物濃度為1mg/mL時(shí)，隨著pH的增大，三種普洱茶提取物對(duì)DPPH自由基的清除率呈下降趨勢(shì)，且兩兩之間差異顯著(p＜0.05)，pH＞8后，三種普洱茶提取物對(duì)DPPH自由基清除率急劇減小，其中以半發(fā)酵紅茶為原料的普洱茶提取物受pH影響變化最大;三種提取物均具有有較強(qiáng)的還原力，并與濃度呈正相關(guān)，且兩兩之間差異顯著(p＜0.05)，還原力順序依次為:以半發(fā)酵紅茶發(fā)酵的普洱茶＞以曬青綠茶發(fā)酵的普洱茶＞以全發(fā)酵紅茶發(fā)酵的普洱茶;三種普洱茶提取物都具有清除羥基自由基的作用，清除羥基自由基的能力依次為:以半發(fā)酵紅茶發(fā)酵的普洱茶＞以曬青綠茶發(fā)酵的普洱茶＞以全發(fā)酵紅茶發(fā)酵的普洱茶;三種普洱茶提取物都具有抑制脂質(zhì)體過(guò)氧化的作用，在濃度0.02～0.04mg/mL范圍內(nèi)，抑制脂質(zhì)體過(guò)氧化能力大小依次為:以曬青綠茶發(fā)酵的普洱茶＞以全發(fā)酵紅茶發(fā)酵的普洱茶＞以半發(fā)酵紅茶發(fā)酵的普洱茶;在濃度0.06～0.10mg/mL范圍內(nèi)，抑制脂質(zhì)體過(guò)氧化能力大小依次為:以全發(fā)酵紅茶發(fā)酵的普洱茶＞以曬青綠茶發(fā)酵的普洱茶＞以半發(fā)酵紅茶發(fā)酵的普洱茶;隨著提取物濃度增大，三種茶葉提取物對(duì)脂質(zhì)體抑制率不斷增大，但以半發(fā)酵紅茶發(fā)酵的普洱茶變化較小。由此可知，三種以不同發(fā)酵原料發(fā)酵的普洱茶都具有抗氧化作用，且都與普洱茶提取物濃度呈現(xiàn)良好的量效關(guān)系，其中以半發(fā)酵紅茶為原料發(fā)酵的普洱茶的抗氧化作用較好。

［1］金裕范，高雪巖，王文全，等.云南普洱茶抗氧化活性的比較研究［J］.中國(guó)現(xiàn)代中藥，2011，13(8):17－19.

［2］李菊，張榮平，鄭梅.普洱茶活性成分藥理作用研究進(jìn)展［J］.中國(guó)民族民間醫(yī)藥，2009(1):21－23.

［3］袁華兵，鐘婕，易娟，等.普洱茶提取物對(duì)飲食誘導(dǎo)肥胖大鼠脂質(zhì)合成相關(guān)基因表達(dá)的影響［J］.營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)，2009，31(2):167－176.

［4］侯艷，肖蓉，徐昆龍，等.普洱茶對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠血清中血脂水平和脂質(zhì)過(guò)氧化的影響［J］.中國(guó)食品學(xué)報(bào)，2009，9(2):80－86.

［5］張冬英，施兆鵬.普洱茶藥理作用研究進(jìn)展［J］.福建茶葉，2005，1:43－44.

［6］李捷，吉俊翠，李修宇，等.普洱熟茶片調(diào)節(jié)血糖的臨床觀察［J］.云南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，32(2):47－48，54.

［7］揭國(guó)良，何普明，丁仁鳳.普洱茶抗氧化特性的初步研究［J］.茶葉，2005，31(3):162－165.

［8］趙龍飛，周紅杰，安文杰.云南普洱茶保健功效的研究［J］.食品研究與開發(fā)，2005，26(2):114－118.

［9］彭長(zhǎng)連，陳少薇，林植芳，等.用清除有機(jī)自由基DPPH法評(píng)價(jià)植物抗氧化能力［J］.生物化學(xué)生物物理進(jìn)展，2007，27(6):658－660.

［10］莫開菊，柳圣，程超.生姜黃酮的抗氧化活性研究［J］.食品科學(xué)，2006，27，9:110－115.

［11］李穎暢，孟憲軍.藍(lán)莓葉黃酮提取物抗氧化活性的研究［J］.營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)，2008，30(4):427－429.

［12］宛曉春.茶葉生物化學(xué)［M］.第三版.中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2003，76－187.

［13］中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局.GB/T 23776－2009茶葉感官審評(píng)方法［S］.北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2009－09－01.

［14］曾磊，張玉軍，鄒政.茶多酚的功能特性及應(yīng)用［J］.鄭州工程學(xué)院學(xué)報(bào)，2002，23(2):90－94.

［15］Su Y L，Leung L K，Huang Y，et al.Stability of tea theaflavins and catechins［J］.Food Chem，2003，83:189－195.