腸膜明串珠菌6055生產低聚葡萄糖的研究

張 寅，干蘇靈，張柏林，*

(1.北京林業大學生物科學與技術學院食品科學與工程系，北京100083;2.江蘇綠揚現代生態農業發展有限公司，江蘇揚州225105)

功能性低聚糖通常被稱作“益生元”，是一類由2～10個單糖通過糖苷鍵連接形成的短鏈糖類聚合物，分子量約為 300～2000u［1］。大多數低聚糖具有整腸、低熱量、增強機體免疫力等功效［2－3］。功能性低聚葡萄糖因其能夠選擇性刺激腸道中有益微生物的生長和活力，而被廣泛應用到多種功能性食品當中［4－5］。

低聚糖可以通過多條途徑獲得［6－8］，包括:a.從植物材料中提取(如低聚半乳糖和低聚果糖);b.多糖的限制性酶解(如低聚木糖和低聚果糖);c.酶促合成(如低聚果糖，β－低聚半乳糖，β－低聚葡萄糖和α－低聚葡萄糖)。目前，國內主要通過淀粉水解制備低聚葡萄糖，但是其制備的功能性低聚糖產物中存在較多的單糖、二糖和麥芽糊精，它們都屬于能被人體消化和吸收的碳水化合物，不能夠選擇性的刺激腸道中有益微生物的生長和活力，極大的降低了功能性低聚糖的功效，而且該方法成本較高，導致低聚糖在工業生產中的應用受到很大的限制。

腸膜明串珠菌自身能夠合成多種關鍵酶，如葡聚糖蔗糖酶和蔗糖磷酸化酶［9］。在有蔗糖存在的條件下，腸膜明串珠菌能夠利用葡聚糖蔗糖酶催化生成聚合度不同的低聚糖［10－11］。腸膜明串珠菌NRRLB－18242代謝生成的α－低聚葡萄糖對腸道中的多種消化酶具有極高的耐受性［12］。本研究嘗試采用生物發酵法制備功能性低聚糖，通過對腸膜明串珠菌6055發酵培養基的選擇、培養條件的優化、產物低聚葡萄糖的純化及其益生性等方面的研究，旨在建立利用腸道明串珠菌發酵制備功能性低聚葡萄糖的具體工藝路線。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

腸膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides subsp.mesenteroides 6055)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae BJFU9.0017)購自中國工業微生物菌種保藏管理中心(CICC);嗜酸乳桿菌NCFM(Lactobacillus acidophilus NCFM)、兩歧雙歧桿菌(Bifidobacterium bifidum Bb－02)商業化益生菌菌株 由上海丹尼斯克公司提供。葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、甘露醇、果糖和潘糖(色譜級)Sigma公司;商業低聚葡萄糖(純度95%)上海三豐生物技術有限公司;其他試劑 均為分析純。G1362A示差折光檢測器、Agilent1200高效液相色譜儀 迪馬公司;UV3010紫外可見分光光度計 日立公司;PHSI－3F實驗室pH計 上海雷磁儀器廠;FA1604N電子分析天平 上海天平儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 低聚葡萄糖定量測定

1.2.1.1 糖標樣的制備 精密稱取麥芽糖、蔗糖、甘露醇、潘糖和果糖標樣各100mg，加去離子水溶解，于250mL容量瓶中定容，搖勻備用。

1.2.1.2 樣品溶液的制備 離心除去發酵液中的細胞，上清液經0.4μm濾膜過濾，去離子水稀釋4000倍后利用Agilent1200高效液相色譜儀進行色譜分析。

1.2.1.3 色譜條件 G1362A示差折光檢測器;色譜柱:Inertsil SIL－100A NH2(4.5×250mm，迪馬公司);柱溫:室溫;流動相:乙腈∶水 =75∶25(V/V);流速:1.0mL/min;進樣量:10μL。

1.2.2 菌株的培養

1.2.2.1 膜明串珠菌6055的培養 將活化三代的膜明串珠菌6055接種于MRS液體培養基中，置于30℃下恒溫培養18h，測定菌體發酵液中低聚葡萄糖的產量及菌體細胞生物量。

1.2.2.2 釀酒酵母的培養 將活化三代的釀酒酵母以2%的比例接種于200mL YEPD培養基中，在30℃恒溫條件下以100r/min的轉速振蕩培養18h。發酵液在8000×g轉速下冷凍離心20min，棄去上清液保留酵母細胞。

1.2.3 細胞生物量測定 離心分離培養的菌體細胞，生理鹽水洗滌后進行梯度稀釋，利用UV3010紫外可見分光光度計于600nm處測其吸光度A值，同時測定細胞干重C(g/L)，繪制吸光度A值與細胞干重的標準曲線。根據樣品的吸光度A值，并利用標準曲線方程計算出菌體的細胞干重。

1.2.4 菌株6055產低聚葡萄糖發酵條件的優化研究1.2.4.1 菌株培養基的優化 以MRS培養基為基礎培養基，分別考察蔗糖與麥芽糖比例、氮源、微量元素對膜明串珠菌6055低聚葡萄糖產量的影響。

1.2.4.2 菌株培養條件的優化 根據高莉莉等關于腸膜明串株菌6055培養的單因素實驗［13］對接種量、初始pH培養、溫度三個因素進行優化，分別記為變量A、B、C，每個因素取3個水平;以低聚葡萄糖產量為響應值，記為Y;利用Box－Behnken設計實驗方案。按照實驗方案，不同培養條件下培養腸膜明串珠菌6055。實驗因素及水平見表1。

表1 響應面實驗的因素和水平Table 1 Factors and levels of response surface analysis

1.2.5 低聚葡萄糖的純化研究 菌株6055發酵液離心后取上清液進行冷凍濃縮，制備低聚葡萄糖濃縮液。以2.0%(v/v)的接種量，將活化好的釀酒酵母接入250mL低聚葡萄糖濃縮液中，30℃下100r/min振蕩培養36h。每隔4h取樣，HPLC法檢測上清液中低聚葡萄糖、雙糖和單糖的含量變化(g/L)。

1.2.6 低聚葡萄糖益生性的研究 將實驗制得的低聚葡萄糖溶于MRS和TPY培養基中，配成2%低聚葡萄糖培養基，滅菌后分別接入嗜酸乳桿菌、雙歧桿菌，37℃厭氧培養24h，以添加葡萄糖的培養基作為對照，采用比濁法和活菌計數法研究低聚葡萄糖對嗜酸乳桿菌、雙歧桿菌生長情況的影響，菌落數表達為log CFU/mL。

1.2.7 數據統計分析 以上實驗均重復3次，并通過SPSS 17.0軟件進行ANOVA方差分析，利用Origin 8.0軟件進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 發酵條件對低聚葡萄糖產量的影響

2.1.1 菌株培養基的優化

2.1.1.1 蔗糖與麥芽糖比例 以蔗糖和麥芽糖為碳源，在其總量為150g/L的前提下，選擇蔗糖和麥芽糖的添加比例分別為 2∶1，4∶1，5∶1，7∶1，測得低聚葡萄糖的產量及菌體細胞生物量如圖1所示。由圖可知，當蔗糖和麥芽糖比例為2∶1時，低聚葡萄糖的產量最高，為1.82g/L;此時，菌株6055表現出最好的生長狀態，菌體細胞生物量達到0.48g/L。菌體的生長情況與低聚糖產量呈正相關。

圖1 不同碳源對低聚葡萄糖產量及腸膜眀串珠菌6055生長的影響Fig.1 Effect of different carbohydrates sources on synthesis of oligosaccharides and the growth of Leuconotoc mesenteroides

2.1.1.2 氮源 以1%的大豆蛋白胨、胰蛋白胨、酵母膏、蛋白胨和硫酸銨為氮源，測得低聚葡萄糖的產量及菌體細胞生物量如圖2所示。由圖2可知，當添加酵母膏作為氮源時，低聚葡萄糖的產量最高，為2.08g/L;此時，菌株6055表現出較好的生長狀態，菌體細胞生物量達到0.47g/L。菌體的生長情況與低聚糖產量呈正相關。

圖2 不同氮源對低聚糖葡萄產量和腸膜眀串珠菌生長的影響Fig.2 Effect of different nitrogen sources on synthesis of oligosaccharides and the growth of Leuconotoc mesenteroides

2.1.1.3 微量元素 在培養基中分別添加0.2%的檸檬酸鈉、氯化鈣、硫酸錳、硫酸鎂、磷酸氫二鉀、硫酸亞鐵作為微量元素，測得低聚葡萄糖的產量及菌體細胞生物量如圖3所示。由圖3可知，當添加K2HPO4和吐溫80時，低聚葡萄糖的產量會明顯提高，其產量分別為2.96和2.80g/L;此時，菌株6055表現出最好的生長狀態，菌體細胞生物量分別為0.51和0.50g/L。菌體的生長情況與低聚葡萄糖產量呈正相關。

綜上所述，實驗確定菌株6055的最適培養基為:蔗糖100g/L，麥芽糖50g/L，酵母膏5g/L，磷酸氫二鉀3g/L，吐溫80 2mL。

2.1.2 菌株培養條件的優化 根據高莉莉等關于腸膜明串株菌6055培養的單因素實驗［13］對接種量、發酵溫度和pH進行優化，設計的響應面實驗共17個實驗點，實驗1～12為析因點，實驗13～17為0點，是區域的中心點。中心實驗重復5次，以減少誤差。實驗設計及實驗結果見表2。

圖3 礦物元素對低聚糖產量和腸膜眀串珠菌生長的影響Fig.3 Effect of different mineral elements on synthesis of oligosaccharides and the growth of Leuconotoc mesenteroides

表2 Box－Behnken實驗設計和實驗結果Table 2 The Box－Behnken experimental design and results

通過SAS軟件的響應面回歸過程對實驗數據進行分析，建立的各實驗因子與響應值之間回歸方程如下所示:

回歸方程中各變量對指標(響應值)影響的顯著性，由F檢驗來判定。pH和溫度的p值小于0.05，表明其對低聚葡萄糖產量的影響顯著，但接種量的p值大于0.1表明其影響不顯著。溫度和pH交互作用的p值小于0.05，表明其對低聚葡萄糖產量的影響顯著，而接種量和pH與接種量和溫度的交互影響均不顯著。整體的回歸方程的p值小于0.05，回歸方程也是顯著的。相關系數R2=0.9989，說明響應值(低聚葡萄糖產量)的變化有99.89%來源于所選變量，即接種量，培養溫度和pH。因此，實驗方程與實際數據之間具有非常好的擬合性。

根據回歸方程，可由SAS軟件作出響應面立體圖(圖4～圖6)。由SAS響應面優化圖可以看出:初始pH和溫度對低聚葡萄糖產量的影響極顯著;接種量對低聚葡萄糖產量也有一定影響，但不顯著。

表3 變量對應值的方差分析及顯著性評價Table 3 Analysis of Variance shoeing significance of variables on responses

圖4 接種量(A)和pH(B)對低聚葡萄糖產量的影響Fig.4 Response surface plot showing the interactive effects of inoculum concentration and initial pH on glucooligosaccharides yield at a fixed level of lincubation temperature

圖5 接種量(A)和溫度(C)對低聚葡萄糖產量的影響Fig.5 Response surface plot showing the interactive effects of inoculum concentration and lincubation temperature on glucooligosaccharides yield at a fixed level of initial pH

通過軟件分析得到最優的培養條件是:接種量為3.02%，發酵溫度為25.50℃，pH為7.09，在此條件下低聚葡萄糖理論產量是5.09g/L。為了檢驗響應面分析的可靠性，以及實際操作性，將最優參數修正為接種量3.0%，發酵溫度25.0℃，pH7.10，此時低聚葡萄糖產量為5.15g/L，與預測值5.09g/L的相對誤差為1.18%。

圖6 pH(B)和溫度(C)對低聚葡萄糖產量的影響Fig.6 Response surface plot showing the interactive effects of initial pH and lincubation temperature on glucooligosaccharides yield at a fixed level of inoculum concentration

2.2 純化過程中低聚葡萄糖含量的變化情況

純化后離心去除釀酒酵母細胞，HPLC檢測上清液中低聚糖、雙糖以及單糖的含量變化情況，結果如圖7所示。

圖7 利用釀酒酵母純化低聚糖產物Fig.7 Purification of oligosaccharide by fermention with Saccharomyces cerevisiae

由圖7可知，前12h，果糖和葡萄糖含量下降的速度很快;24h內，葡萄糖和果糖基本被全部清除。前4h，由于總糖度較高，釀酒酵母的發酵作用受到抑制，麥芽糖的降解速度相對較慢;4～12h之間，隨著總糖度的降低，底物抑制作用解除，麥芽糖被迅速降解。前28h，可消除100%的果糖和葡萄糖，以及92.8%的麥芽糖，而低聚葡萄糖幾乎不被降解，從而使低聚葡萄糖占總糖的比例升高至74.3%。因此，本實驗將純化發酵的時間確定為28h。

2.3 低聚葡萄糖益生性的研究

將嗜酸乳桿菌、雙歧桿菌分別接種于以實驗制得低聚葡萄糖作為碳源的培養基中，每隔4h取樣，以不含低聚葡萄糖的MRS和TPY培養基為對照，測定培養液的吸光值;菌液10倍遞增稀釋后涂布平板，活菌計數。菌體的生長狀況如圖8所示。

由圖8可知，以葡萄糖為碳源時，嗜酸乳桿菌和雙歧桿菌在12h以后才會進入生長穩定期，其最大細胞生物量僅為0.31和0.35g/L，最大活菌數僅為8.58和8.99log CFU/mL;而以低聚葡萄糖為碳源時，菌體在8h時就已進入生長穩定期，最大細胞生物量為0.44和0.54g/L，最大活菌數為9.05和9.43log CFU/mL。

3 討論

培養基組分明顯影響腸膜明串珠菌產低聚葡萄糖的代謝過程［11，14］。Yoo等人證實蔗糖和麥芽糖的比例與低聚糖產量有較大關系［15］。本次研究中證實，蔗糖和麥芽糖比例不同(即2∶1、4∶1、5∶1 和7∶1)低聚糖產量不同，蔗糖和麥芽糖的比例越低低聚糖的產量越大，即當蔗糖和麥芽糖的比例為2∶1時低聚糖的產量最大。Martha Argüello－Morales等人證實酪蛋白、細菌蛋白胨、胰蛋白胨、酵母粉等氮源與膜明串珠菌低聚糖產量存在較大關系［16］。本次研究表明，培養基添加的氮源不同，低聚葡萄糖的產量確實存在明顯的差異:當以酵母膏為氮源時菌株6055的低聚葡萄糖產量可達到最高;而以硫酸銨為無機氮源時，低聚葡萄糖產量最低。吐溫80和磷酸氫二鉀可增加葡聚糖蔗糖酶的活力［17］。本文研究表明，吐溫80和磷酸氫二鉀可以增加葡聚糖蔗糖酶的活力來增加菌株6055低聚葡萄糖的產量。這與F Mozzi等人有關葡聚糖蔗糖酶的活性越高低聚糖的產量越大的研究結果是一致的［18］。

腸膜明串株菌產低聚葡萄糖的最適培養條件與菌體的最佳生長條件基本相同［19］。而本次研究得到的菌株6055產低聚葡萄糖的最優培養條件是:接種量為3.0%，發酵溫度為25.0℃，pH為7.10。由《伯杰氏細菌鑒定手冊》可知，此時并沒達到菌株6055的最佳生長條件，這與Bellengier等人關于腸膜明串株菌可在亞適宜條件下生成最大量低聚葡萄糖的結論是一致的［20］。

Harder等人證實利用微生物發酵法可去除蔗糖、麥芽糖、葡萄糖等非功能性低聚糖成分［21］。本實驗證實在37.5%的低聚葡萄糖發酵液中接入2%的釀酒酵母，發酵28h后，可除去發酵液中100%的果糖和葡萄糖、以及92.8%的麥芽糖，使低聚葡萄糖含量升高至74.3%。因此，利用釀酒酵母除去發酵液中的糖有利于低聚葡萄糖的進一步純化。

圖8 低聚葡萄糖對嗜酸乳桿菌NCFM、雙歧桿菌300B生長的影響Fig.8 Influences of oligosacharide sourees on the growth of Bifidobacterium bifidum 300B and Bacillus acidophilus NCFM

功能性低聚糖作為碳源時，能夠較為明顯的促進雙歧桿菌的生長和繁殖［22－23］。采用本研究獲得的低聚葡萄糖來替代葡萄糖作為碳源時，商業化嗜酸乳桿菌的最大細胞生物量和最大活菌數分別增加0.13g/L和0.47log CFU/mL，商業化雙歧桿菌的最大細胞生物量和最大活菌數分別增加0.19g/L和0.44log CFU/mL，嗜酸乳桿菌和雙歧桿菌分別增殖37.9%和48.6%。這一結果說明采用本篇方法獲得的低聚葡萄糖具有促進腸道有益微生物生長的效果，或許可以作為潛在的益生元來應用。

4 結論

4.1 優化后腸膜明串珠菌6055發酵條件可以明顯提高低聚葡萄糖產量，結合釀酒酵母除糖可以提高功能性低聚葡萄糖的純度，從而獲得了一條完整的腸膜明串珠菌6055發酵生產功能性低聚葡萄糖的工藝路線。

4.2 當采用蔗糖 100g/L，麥芽糖 50g/L，酵母膏5g/L，磷酸氫二鉀3g/L，吐溫80 2mL的培養基質，通過控制3.0%接種量，發酵溫度25.0℃和pH為7.10發酵條件，菌株6055發酵18h生成的低聚葡萄糖量最多，為5.15g/L;進一步采用2%的釀酒酵母發酵28h可以使發酵液中低聚葡萄糖含量從37.5%升高到74.3%。

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