雙酶法制備奶味香精的研究

王孟輝，陳 靜，關志涵，錢文濤，王 斌，胡鵬麗，李洪亮，母智深

(內蒙古蒙牛乳業(集團)股份有限公司，內蒙古呼和浩特011500)

奶味香精，也稱作乳香香精、乳香香味劑，是一種具有奶香香氣的食品添加劑。與奶制品的品種相對應，奶味香精分為鮮奶、煉奶、奶油、黃油干酪、酸奶等香型［1－2］。它是食品工業中應用最為廣泛的香精之一，從膨化食品到糖果炒貨食品，從冷飲到飲料，從乳制品到非乳品都有其用武之地。目前，國內張之滌［3］，王璋等［4］，李雁群［5］等人利用不同來源的酶制劑制得的增味物質對乳香香精進行修飾，從而大大提高天然乳品香精的品質，武彥文等［6］脂肪酶對不同類型的奶油、奶酪和牛奶等進行酶解，得到了奶香濃郁，賦香效果明顯的奶味香精。國外Toelstede S等［7］人利用乳蛋白酶解產物中的增味物質配制成各種天然牛奶或奶酪香精，可以顯著增強香精中乳滋味的濃厚感與持久感。Balcao V M等［8］，King R D等人［9］對奶油酶解增香的研究主要集中在特異性脂肪酶對酶解底物水解程度的控制以及脂肪酶的固定化兩個方面。Kirimura J 等［10］，Arnold R G 等人［11］利用不同來源的脂肪酶對乳脂肪進行適當酶解，通過控制酶解程度以得到具有不同奶香特征的產物，從而達到增香的目的。中國是世界上人口最多的國家，每年對奶香精的消耗量十分巨大，隨著人們生活水平的提高，消費者對奶香精品質的要求將越來越高，在滿足口感的同時，天然、安全、健康、多樣化的產品將成為消費者需求的方向。而市場的發展趨勢是淘汰無核心技術的簡單重復開發產品，因此，開發天然、綠色、健康的產品具有廣闊的發展前景和巨大的市場空間。本研究采用雙酶結合可控酶解技術對稀奶油進行酶解，先采用蛋白酶將稀奶油中的蛋白質水解，產生小分子肽及多肽類的呈味物質，使產品味道自然柔和，然后再加入脂肪酶對脂肪進行酶解，進而釋放出更多的呈味物質，促使酶解產物強度增加、風味豐富、香味十足，為工業化生產奶味香精提供一條新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

稀奶油 蒙牛乳業;脂肪酶CR 美國萬力;復合蛋白酶ProTamEx1.17L 諾維信;磷酸氫二鈉(純度97%)、磷酸二氫鈉(純度98%)吳江市杰達化工有限公司。

FLUKO乳化器 上海弗魯克流體機械制造公司;酸度計 上海精密科學儀器有限公司;JB－50D型增力電力攪拌機 上海南匯慧明儀器廠;DK－S22電熱恒溫水浴鍋 上海精宏實驗設備有限公司;AB204－N電子天平 梅特勒－托利多儀器有限公司;恒溫搖床 上海精宏實驗設備有限公司;Agilent 7890 A/5975C氣相色譜質譜聯用儀 安捷倫科技有限公司;S433D型全自動氨基酸分析儀 北京捷盛依科科技發展有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 復合蛋白酶酶解方法

1.2.1.1 酶添加量 稱取適量稀奶油調節體系的pH為6.0，分別加入 0.01%、0.02%、0.03%、0.04% 和0.05%比例的酶(加酶量為酶與底物的百分比)，控制溫度45℃，轉速150r/min，進行水解反應，3.5h后測定稀奶油中蛋白質的水解度。

1.2.1.2 酶解溫度 稱取適量稀奶油調節體系的pH為6.0，加酶量為 0.04%，溫度分別 30、35、40、45、50℃，轉速150r/min，進行水解反應，3.5h后測定稀奶油中蛋白質的水解度。

1.2.1.3 酶解時間 稱取適量稀奶油調節體系的pH為6.0，加酶量為0.04%，溫度40℃，酶解時間分別為2.5、3.5、4.5、5.5、6.5h，轉速 150r/min，進行水解反應，完畢后測定稀奶油中蛋白質的水解度。

1.2.1.4 正交實驗因素水平表 在單因素實驗的基礎上，采用L9(34)正交實驗，研究加酶量、酶解溫度和時間三因素對稀奶油水解度的影響，因素水平見表1。

表1 L9(34)正交實驗水平因素表Table 1 Factors and levels of L9(34)orthogonal test

1.2.2 脂肪酶CR水解稀奶油酶解方法

1.2.2.1 酶添加量 稱取適量稀奶油調節體系的pH為7.0，分別加入 0.03%、0.04%、0.05%、0.06% 和0.07%比例的酶(加酶量為酶與底物的百分比)，控制溫度40℃，轉速150r/min，進行酶解反應，14h后測定酶解稀奶油的酸價。

1.2.2.2 酶解溫度 稱取適量稀奶油調節體系的pH為7.0，加酶量為 0.06%，溫度分別 30、35、40、45、50℃，轉速150r/min，進行水解反應，14h后測定酶解稀奶油的酸價。

1.2.2.3 酶解時間 稱取適量稀奶油調節體系的pH為7.0，加酶量為0.06%，溫度45℃，酶解時間分別為12、14、16、18、20h，轉速 150r/min，進行水解反應，完畢后測定酶解稀奶油的酸價。

1.2.2.4 正交實驗因素水平表 在單因素實驗的基礎上，采用L9(34)正交實驗，研究加酶量、酶解溫度和酶解時間三因素對稀奶油酸價的影響，因素水平見表2。

表2 L9(34)正交實驗水平因素表Table 2 Factors and levels of L9(34)orthogonal test

1.2.3 水解度測定 氨基態氮含量的測定:甲醛法［14－16］測定，總氮含量的測定:凱氏定氮法，參照 GB/T5009.5。

1.2.4 酸價的測定 酸價測定采用酸堿中和法［17－18］。

注:V－滴定消耗的氫氧化鉀溶液體積mL;N－氫氧化鉀溶液當量濃度mol/L;56.1－氫氧化鉀的毫克當量;W－試樣重量g。

1.2.5 感官評定方法 將稀奶油酶解物在玻璃奶瓶中搖勻，待分層現象完全消失、顆粒上下浮游較為均勻時，用膠頭滴管吸取少量樣液于燒杯中，用水溫約30℃的純凈水稀釋成濃度為0.2%的溶液，攪拌均勻，用以進行感官評定，總分為10分(其中氣味、滋味各占5分)，氣味和滋味所得分值相加即為感官分值，各評香師所得分值總和與評香師人數比值即為最終感官分值，本文參與感官評價人員12人，人員組成見表 3，評分標準見表 4［19］。

表3 感官評價人員組成表Table 3 Staff composition of sensory evaluation

1.2.6 GC－MS分析法 采用Agilent 7890 A/5975C氣相色譜質譜聯用儀 EMV:1500V;離子源溫度:230℃;MASS range:29～500amu;柱溫:57～260℃(4℃/min、最高溫時保持10min);柱流過:1mL/min(He)［12，20］。

表4 稀奶油酶解物感官評分標準Table 4 Sensory evaluation standard of cream hydrolysate

1.2.7 氨基酸分析 采用S433D型全自動氨基酸分析儀 色譜柱:AccQ·Tag;氨基酸分析柱(3.9×150mm，4μm);流速:1mL/min;柱溫:37℃;進樣量:10μL;檢測波長:248nm［13］。

2 結果與分析

2.1 復合蛋白酶水解稀奶油的工藝條件

2.1.1 加酶量對蛋白水解度的影響 從圖1中可以看出，隨著加酶量的增加，水解度在不斷增大，水解度的增加幅度減小，當加酶量在0.04%時，水解度達到最大，隨著加酶量增加水解度在下降，可能酶在酶解過程中水解度達到最大值時，本身不進行作用，而自身又是蛋白質導致水解度降低，故選擇加酶量為0.04%。

圖1 不同加酶量對稀奶油水解度的影響Fig.1 Effect of proteinase dosage on degree of hydrolysis of cream

2.1.2 溫度對蛋白水解度的影響 從圖2可以看出，隨著酶解溫度的增加，水解度不斷增大，酶解溫度升高到40℃后，水解度不升反而降低，酶促水解反應在40℃時，反應速度快，低于此溫度時，酶活力低，水解度低;當溫度高時，由于酶逐漸產生變性作用而減弱甚至喪失其催化活力，導致反應速度降低。本實驗中，酶解最適溫度為40℃。

2.1.3 酶解時間對蛋白水解度的影響 如圖3隨著反應時間的增加，水解度在增大，到4.5h以后，水解度增加的幅度在減小，說明在4.5h之內，水解率隨反應時間增加而升高;4.5h之后，底物量不斷減少，酶活力下降，反應速度增加幅度降低，導致水解率反而降低，故選擇酶解時間4.5h。

圖2 酶解溫度對稀奶油水解度的影響Fig.2 Effect of enzymolysis temperature on degree of hydrolysis of cream

圖3 酶解時間對稀奶油水解度的影響Fig.3 Effect of enzymolysis time on degree of hydrolysis of cream

2.1.4 正交實驗結果分析 在酶水解過程中，各因素之間存在極為復雜的交叉作用和互補作用，從而影響著酶解程度。為優化水解條件，在單因素實驗基礎上，采用了L9(34)正交實驗，研究酶用量、溫度、反應時間三因素對水解度的影響(固定反應體系的pH6.0，由酶本身的性質決定)。由極差分析知:酶用量是此反應的關鍵，溫度次之，作用時間影響最小。最優水解條件為:加酶量為0.04%，溫度45℃，酶解時間3.5h，蛋白質的水解度達到17.3%。

表5 L9(34)正交實驗結果Table 5 Results of L9(34)orthogonal test

2.2 脂肪酶CR水解稀奶油的工藝條件

2.2.1 加酶量對脂肪酶酶解反應的影響 從圖4中可以看出，隨著加酶量的增加，酸價在不斷增大，開始曲線的斜率由小變大，隨著加酶量的增加，曲線斜率在減小，當加酶量大于0.06%時，酸價增加的幅度減小但仍具有增加的趨勢，從能耗和生產周期等綜合因素考慮，加酶量0.06%較為合適。

圖4 加酶量對酶解稀奶油酸價的影響Fig.4 Effect of proteinase dosage on acid value of cream

2.2.2 溫度對脂肪酶酶解反應的影響 從圖5可以看出，隨著酶解溫度的增加，開始酸價在不斷增大，當酶促水解反應在45℃時，反應速度最快，低于此溫度時，酶活力低，解脂率低;當溫度高時，可能是酶在作用的同時自身逐漸變性導致酶活減弱甚至喪失其催化活力，使其反應速度降低。結合實際情況選擇酶解溫度為45℃。

圖5 溫度對酶解稀奶油酸價的影響Fig.5 Effect of enzymolysis temperature on acid value of cream

2.2.3 時間對脂肪酶酶解反應的影響 如圖6所示，隨反應時間的增加，酸價在增大，到16h以后，酸價增加的幅度在減小，說明在16h之內，解脂率隨反應時間增加而增大;16h之后，隨著底物濃度不斷的減少，酶活力下降，酸價增長趨勢逐漸減緩，選擇16h較為合適。

2.2.4 正交實驗結果分析 通過表6的極差分析可知，其他因素不變的情況下，對水解度影響最大的因素為酶解溫度(R=9.867)，加酶量次之(R=9.666)、而酶解時間(R=6.866)，其大小順序為:B(酶解溫度)＞A(加酶量)＞C(酶解時間)，根據正交實驗結果得出，最優工藝組合為 A2B2C3，即加酶量為0.06%，溫度45℃，酶解時間18h，酶解稀奶油的酸價為55.4。

2.3 稀奶油酶解物揮發性成分分析

圖6 時間對酶解稀奶油酸價的影響Fig.6 Effect of enzymolysis time on acid value of cream

采用GC－MS方法對稀奶油原液及雙酶結合分步酶解方法制得的稀奶油酶解物進行揮發性香氣成分的分析，結果如表7所示。

表6 L9(34)正交實驗結果Table 6 Results of L9(34)orthogonal test

從GC－MS的分析報告數據表7來看，酶解后的稀奶油與原料相比，含量較高的組分仍是脂肪酸、酯、醛、醇、酮和硫化物等物質，種類差別不大，這些物質是重要的揮發性香氣組成部分。但短鏈及中鏈脂肪酸，如癸酸、辛酸、丁酸等，含量大大增加，對揮發香氣的加強有很大作用。說明酶解過程中主要進行了脂肪酸甘油三酯的降解，在脂肪酶的作用下，水解出了大量游離脂肪酸，使稀奶油風味中的脂肪酸特征被釋放出來。由于稀奶油風味的形成是一個各種風味物質協同產生的復雜過程，在進行酶解以及風味濃縮生產香精的過程中，要做到稀奶油風味的原汁原味維持，是一個需要全面而細致的控制和研究。

2.4 稀奶油酶解物氨基酸成分分析

采用氨基酸自動分析儀對稀奶油原液及其酶解物進行氨基酸成分分析，結果如表8所示。

由表8的氨基酸分析表明，酶解液氨基酸總量達23.80mg/g，相比酶解前增長了約十二倍。其中必需氨基酸種類齊全，含量占總氨基酸含量的59.13%。與原料相比，除天門冬氨酸外，其它氨基酸含量都大幅升高。

表7 稀奶油原料及酶解物香氣成分比較Table 7 Comparison of compound aroma of cream materials and enzymatic components

續表

表8 稀奶油原料及酶解物氨基酸成分比較Table 8 Comparison of amino acid of cream materials and enzymatic components

增幅最大的氨基酸是組氨酸，增長了62倍，其他增加幅度較高的依序有異亮氨酸、亮氨酸和纈氨酸，這幾種氨基酸也在酶解物中具有較高的含量。

3 結論

從GC－MS的分析數據來看，酶解后的稀奶油與原料相比，短鏈及中鏈脂肪酸，如癸酸、辛酸、丁酸等，含量大大增加，對揮發香氣的加強有很大作用。甲基酮類和內酯類物質相比之下含量較少，從而突顯了酶解稀奶油特殊的風味。通過氨基酸分析表明，酶解液氨基酸總量達23.80mg/g，相比酶解前增長了約12倍。其中必需氨基酸種類齊全，含量占總氨基酸含量的59.13%。與原料相比，除天門冬氨酸外，其它氨基酸含量都大幅升高。氨基酸含量的變化也間接地說明蛋白酶在酶解過程中除產生氨基酸外，同時也產生了大量的沒有徹底變成氨基酸的多肽類物質，而多肽類物質中含有的風味肽能使奶味香精呈現出更加飽滿自然的香氣，經感官分析，本研究制備的奶味香精具有濃度高、香味醇等特點。

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