酵母突變株Y518的生理特性分析

劉莉娟，朱益波，齊 斌，王立梅，*

(1.蘇州大學基礎醫學與生物科學學院，江蘇蘇州215123;2.常熟理工學院發酵工程技術研究中心，蘇州市食品生物技術重點實驗室，江蘇常熟215500)

釀酒酵母(Saccharomyces cerevisia)是重要的模式生物，廣泛應用于發酵和釀造工業，同時釀酒酵母也是工業上生產谷胱甘肽的常見菌株［1］。在釀造工業中，釀酒酵母易發生突變，產生呼吸缺陷型，主要是線粒體缺失染色體阻斷了電子傳遞鏈。呼吸缺陷型酵母細胞和正常酵母細胞在形態上無多大差別，菌落較正常者小。由于其菌落較小，又稱為小菌落突變型(Petite Mutant)［2－4］。

研究發酵菌株的生理特性以及代謝調控，有助于揭示其生命活動機理，并可以通過改變細胞的生理狀態來提高目標產物的合成，這對發酵工業具有重要指導意義［5］。本實驗室采用亞硝基胍對一株釀酒酵母菌株2－10515進行誘變，并獲得一株高產GSH的突變株Y518［6］。為了解突變菌株Y518的發酵特性，本文對突變菌株Y518發酵過程中的生理特性進行了研究，以期為Y518在工業化生產過程中的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

釀酒酵母2－10515與Y518為本實驗室保藏;3，5－二硝基水楊酸(DNS)國藥集團化學試劑有限公司;2，3，5－氯化三苯基四氮唑(TTC)上海金穗生物科技有限公司;十二烷基磺酸鈉(SDS)北京鼎國生物技術責任有限公司;其他所用試劑均為分析純;YEPD培養基 葡萄糖20g，蛋白胨20g，酵母提取物10g，用水定容至 1000mL，pH6.0;發酵培養基［7］葡萄糖20g，酵母提取物5g，硫酸銨5g，磷酸二氫鉀6g，硫酸鉀 3g，硫酸鎂1.5g，用水定容至 1000mL，pH6.0;TTC培養基［8］下層:葡萄糖1%，酵母提取物0.15%，蛋白胨0.2%，磷酸二氫鉀0.15%，硫酸鎂0.04%，瓊脂2%;上層:葡萄糖 0.5%，瓊脂 1.5%，滅菌;TTC1%，無菌膜過濾后，兩者于50℃混合;醋酸鈉固體培養基［9］醋酸鈉20g，酵母提取物 5g，蛋白胨 20g，瓊脂20g，用水定容至1000mL。

UV－2450分光光度計 SHIMADZU公司;超聲波細胞破碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司;高速臺式離心機 Thermo公司;高效液相色譜儀SHIMADZU公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種培養 活化后的菌株接種到YEPD培養基中過夜培養，以10%的接種量接種到發酵培養基中進行發酵，30℃，180r/min，定時取樣。

1.2.2 菌落形態比較 制備適當濃度的菌體懸浮液，涂布培養觀察其菌落形態。

1.2.3 細胞濃度測定 采用比濁法。取不同時間的發酵液4mL于4℃，10000r/min離心5min，棄上清，并用生理鹽水洗滌菌體后稀釋20倍，測定發酵液OD600值。

1.2.4 殘糖含量測定 采用3，5－二硝基水楊酸法(DNS法)［10］。取樣后稀釋20倍在520nm處比色測定。

1.2.5 發酵pH測定 用pH計測定發酵液的pH。

1.2.6 菌體蛋白含量測定 取不同時間的發酵液4mL于4℃，10000r/min離心10min，收集菌體，并用0.85%NaCl洗3次。加入95℃的SDS樣品緩沖液500μL，煮沸 5min，冰浴上冷卻，加入 500μL 硫脲裂解液，室溫輕微振蕩1h，超聲破碎5min，10000r/min離心5min，取上清液［11］。用Lowry法定量蛋白濃度，以牛血清白蛋白為標準蛋白。

1.2.7 乙醇和甘油含量測定 準確量取4mL發酵液，經12000r/min離心5min后取上清液，經0.22μm水系膜過濾后用高效液相色譜儀進行測定。色譜條件［12］為:Aminex HPX－87H柱有機酸分析柱(300mm×7.8mm);流動相:0.05mol/L H2SO4;流速:0.5mL/min，進樣量:5μL;柱溫:50℃;示差折光檢測器溫度:50℃。

1.2.8 TTC檢測 菌種活化培養后稀釋到適當濃度，在TTC下層培養基涂布，30℃培養2～3d，小心覆蓋TTC上層培養基，避光30℃培養3～4h，觀察菌落顏色［8］。

1.2.9 醋酸鈉培養基培養 菌種活化培養后稀釋到適當濃度后涂布在醋酸鈉培養基上，30℃培養2～3d，觀察菌落生長情況。

2 結果與討論

2.1 Y518與2－10515生長性能的比較

將同樣濃度的Y518和2－10515菌液進行涂布后培養2～3d，觀察二者的菌落形態。從圖1中可以看出二者的菌落形態無明顯差別，Y518的菌落較2－10515小。在同樣條件下培養Y518和2－10515，每4h取樣測定菌體濃度。結果表明兩者的生長趨勢幾乎相同，接種到新鮮培養基后迅速開始生長，在48h達到最大值。但是Y518生長速率緩慢，其生長的最大值(OD600為15.67)低于原始菌株2－10515(OD600為19.32)(圖2)。

圖1 突變株Y518和原始菌株2－10515的菌落形態的比較Fig.1 The difference in colonial morphology between Y518 and 2－10515

圖2 突變株Y518和原始菌株2－10515細胞生長比較Fig.2 The difference in cell growth between Y518 and 2－10515

2.2 Y518和2－10515的葡萄糖代謝及發酵液pH的變化

葡萄糖作為YEPD培養基中的碳源，其代謝活性可表征微生物的生理生化狀態和生物活性。從圖3中可以看出2－10515與Y518葡萄糖消耗的趨勢一致，在6h時發酵液中的葡萄糖消耗完畢。但是與2－10515相比，Y518的耗糖速率明顯減慢。隨著發酵的進行，細胞大量合成乙酸、乳酸并積累二氧化碳等酸性物質，引起 pH下降［5］。從圖4中可以看出Y518在12h時前與2－10515的發酵pH相似。隨著代謝的進行，Y518的發酵液pH逐漸低于2－10515，這可能是Y518的代謝通路發生改變，酸代謝變慢導致的。

圖3 不同發酵時間發酵液中葡萄糖含量Fig.3 Content of glucose at different fermentation time

圖4 Y518和2－10515的發酵液pH比較Fig.4 Changes of pH between Y518 and 2－10515

2.3 TTC檢測

由于突變菌株Y518的平板菌落形態與2－10515差別不大，但是菌落小，生長速率慢，因此推斷Y518可能發生了呼吸缺陷突變。實驗中采用TTC［8］染色來鑒定突變菌株Y518是否為呼吸缺陷型菌株。TTC(2，3，5－氯化三苯基四氮唑)是一種能與氧氣競爭呼吸鏈中的還原氫產生三苯基甲腈(TF，在細胞內以紅色結晶體形式存在)的顯色劑。呼吸正常的酵母能夠產生還原氫還原TTC使菌落呈紅色，而呼吸缺陷型酵母因線粒體基因部分缺失不能產生還原氫，不能還原TTC生成紅色的TF，所以菌落呈白色。實驗結果表明，Y518經 TTC(圖5A)染色為白色，而2－10515經TTC染色為紅色。

圖5 Y518和2－10515的TTC檢測(A)和對非發酵型物質醋酸鈉(B)的反應Fig.5 TTC staining(A)and reaction on the non－fermented material acetic acid sodium(B)of Y518 and 2－10515

為做進一步確定，根據呼吸缺陷型酵母不能氧化非發酵性物質，如甘油、醋酸等的原理［2］。將活化的菌種在醋酸鈉培養基上涂布，觀察其生長情況。結果表明突變菌株Y518在醋酸鈉(圖5B)為碳源的培養基上不能生長，而原始菌株2－10515在醋酸鈉培養基上生長良好。

2.4 Y518與2－10515的菌體蛋白含量比較

從蛋白水平來看，突變菌株Y518和原始菌株2－10515的蛋白表達有著明顯的差異。Y518的菌體蛋白表達量始終高于2－10515。Y518蛋白的高表達可能是與原始菌株2－10515相比Y518對環境變化更敏感，再加上發酵的過程中產生的各種脅迫，其通過提高相應的應激蛋白的表達和分泌以保證菌體的生存。

圖6 Y518和2－10515的菌體蛋白表達量Fig.6 Changes of cell total protein of Y518 and 2－10515

2.5 Y518和2－10515乙醇和甘油產量分析

同樣條件下培養Y518和2－10515，不同時間點取樣檢測發酵液中乙醇和甘油含量。從圖7中可以看出在發酵初期原始菌株2－10515的乙醇產量高于突變株Y518。隨著發酵的進行，Y518和2－10515的乙醇產量越來越接近，分別為69.91g/L和72.56g/L。從圖8中可以看出，在發酵的過程中 Y518和2－10515的甘油產量逐漸降低，而且Y518產生的甘油的量低于2－10515。甘油不僅可以保護酵母高滲脅迫的作用，還能在厭氧或微氧條件調節酵母細胞胞內氧化還原電勢平衡的重要途徑之一［13］。對比甘油和生長量、葡糖糖消耗以及菌體蛋白的發酵規律可以推測，由于甘油的保護作用，2－10515生長迅速，代謝正常，而Y518的甘油產量低，故生長緩慢，代謝發生了改變。

圖7 發酵過程中Y518和2－10515的酒精產量比較Fig.7 Ethanol production of Y518 and 2－10515 in the process of fermentation

3 結論

圖8 發酵過程中Y518和2－10515的甘油產量比較Fig.8 Glycerol production of Y518 and 2－10515 at different fermentation time

本實驗對經亞硝基胍誘變得到的酵母突變株Y518進行了初步的生理生化研究，發現與原始菌株2－10515相比，Y518在生理和代謝上發生了顯著變化，而且其呼吸存在缺陷。這些數據不僅為接下來的代謝和轉錄組等方面研究提供實驗依據，也為以后的發酵條件改進提供指導。

［1］陳葉福，李軍俠，沈世超，等.釀酒酵母谷胱甘肽產量與鎘鹽抗性關系的研究與應用［J］.中國釀造，2012，31(4):40－43.

［2］鮑曉明，高東.酵母菌呼吸缺陷型的選育［J］.華中農學院學報，1984，3(2):44－47.

［3］王莉，陽蕾.啤酒酵母呼吸缺陷型菌株的檢測［J］.啤酒科技，2002，2:10－12.

［4］Viktor K，Margita O，Jitka U，et al.Induction of respirationdeficient mutants in Saccharomyces cerevisiae by chelerythrine［J］.FEMS Microbiology Letters，1994，120:87－92.

［5］王繼花，薛永常，高圣，等.高滲脅迫下啤酒酵母的生理特性研究［J］.中國釀造，2008，5:45－47.

［6］王雅楠，梅艷珍，鄭麗雪，等.酵母突變株Y518谷胱甘肽合成酶結構分析［J］.食品科學，2009，30(17):258－261.

［7］江潔，卜紅宇.釀酒酵母菌產谷胱甘肽的發酵條件研究［J］.中國釀造，2009，(1):59－61.

［8］吳小映，李慧萍，何春燕，等.呼吸缺陷型酵母發酵性能研究［J］.啤酒科技，2007，4:18－21.

［9］趙炯，中藥抗真菌活性測定和酵母利用非發酵碳源基因的篩選［D］.天津:天津大學，2007.

［10］舒馨，劉雄民，梁秋霞，等.3，5－二硝基水楊酸吸光光度法測定八角殘渣中總糖，還原糖含量［J］.食品工業科技，2010，31(6):341－343.

［11］Alois H，Robert W，Arek N，et al.Comparison of yeast cell protein solubilization procedures fortwo－dimensional electrophoresis［J］.Electrophoresis 1999，(20):826－829.

［12］袁文杰，孔亮，孜力汗，等.高效液相色譜法測定克魯維酵母菊芋發酵液中的乙醇，糖和有機酸類代謝成分［J］.分析化學，2009，37(6):850－854.

［13］陳獻忠，王正祥，諸葛健.酵母細胞甘油代謝與生理功能研究進展［J］.中國生物工程雜志，2010，30(5):140－148.