高效液相色譜 串聯質譜法測定油條中羧甲基賴氨酸

孫曉華，賴克強，黃軼群，王 婧，*，吳 軼，肖竹青

(1.上海海洋大學食品學院，上海201306;2.上海市食品研究所，上海200235)

晚期糖基化終末產物(AGEs)是美拉德反應產生的一類復雜的化合物，主要由脂質氧化途徑和還原糖(及其氧化產物)與蛋白質的游離氨基通過非酶褐變途徑產生［1］。食品熱加工的過程中容易產生AGEs，有研究者發現，大約10%的食源性AGEs可以被吸收進入體內循環，并隨著年齡的增長在體內累積［2］。人體內AGEs的積累與人類許多疾病都有著密不可分的關系，包括糖尿病、腎病、阿茨海默爾病、衰老和動脈粥樣硬化等［3－4］。因此，控制 AGEs含量高的食品的攝入對于人類預防這類疾病尤其重要。AGEs主要包括:羧甲基賴氨酸(CML)、羧乙基賴氨酸(CEL)、戊糖素(Pento－s)、吡咯啉(Pyr)等。其中，CML最先在食品中被檢出，在實驗室研究中通常被作為食品中AGEs產生的標志性物質［5］。

大多數AGEs可以自發熒光，許良元等人［6］主要研究了利用熒光光譜技術檢測人體中的AGEs。但CML不能自發熒光，傳統的用于 CML檢測的方法——酶聯免疫法(ELISA)［7－8］、高效液相色譜熒光檢測法(HPLC－ FLD)［5，9］、氣相色譜－ 質譜聯用法(GC－MS)［10］都存在不同程度的缺陷。由于食品體系比較復雜，ELISA法特異性抗體選擇比較困難，定量分析結果不可靠;HPLC－FLD和GC－MS法都需要將樣品衍生化，樣品處理復雜，衍生產物不穩定。而高效液相色譜－質譜聯用法(HPLC－MS/MS)可以避免復雜的樣品衍生化處理，能夠進行準確定量。目前已經報道的 HPLC－MS/MS檢測 CML 的方法［11－14］存在很大缺陷和不足，多數使用C18色譜柱進行分離，C18固相萃取小柱進行凈化。而CML極性極強，如要達到在C18柱上保留必須使用離子對試劑。而離子對試劑會降低色譜柱壽命并污染質譜的離子源。本方法首次研究用HILIC親水作用色譜柱進行分離，MCX混合型陽離子交換固相萃取小柱對提取液萃取凈化，在CML的提取和檢測過程中都無需使用離子對試劑即可得到適當保留，同時避免了HPLC－FLD和GC－MS法復雜的樣品衍生化處理過程，分析時間短，簡便快速。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

37%鹽酸、氫氧化鈉、硼氫化鈉、甲酸、乙酸銨、三氯甲烷、95%乙醇、硼酸、硼酸鈉、甲基紅、溴甲酚綠、硫酸銅、硫酸鉀、氨水、濃硫酸 分析純，國藥集團;甲醇 HPLC級，美國 Sigma公司;CML標準品(純度98%，CAS號 5746－04－3)、D4－CML 標準品(純度98%)加拿大TRC公司。實驗室用水為Milli－Q超純水。CML和D4－CML標準品分別溶解在80%甲醇水溶液中，配成100mg/L溶液，儲存在－20℃冰箱里備用，可保存6個月。

2695 Quattro Micro型液相色譜質譜聯用儀(配套MassLynxV 4.1型數據采集及處理軟件)、Atlantis HILIC親水作用色譜柱(150mm ×2.1mm，3μm)、SunFire C18液相色譜柱(150mm × 2.1mm，5μm)、OASIS MCX混合型陽離子交換固相萃取小柱(60mg/3mL)美國Waters公司;DZF－6050型真空干燥箱 上海精宏真空設備有限公司;TDL－5－A型離心機 上海安亭科學儀器廠;UDK159全自動凱氏定氮儀 意大利VELP公司;Milli－Q超純水儀 美國Millipore公司;Supelclean LC－18固相萃取小柱(500mg/3mL)、Supelclean Alumina A酸性氧化鋁小柱(100mg/3mL)美國Supelco公司;CNW SCX陽離子交換固相萃取小柱(500mg/3mL)上海安譜科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 HPLC條件 Atlantis HILIC親水作用色譜柱(150mm ×2.1mm，3μm);進樣量 10μL;流動相速率0.2mL/min;柱溫35℃;流動相A為甲醇(含0.1%甲酸和2mmol/L乙酸銨)，B為水(含0.1%甲酸和2mmol/L乙酸銨)。進行梯度洗脫，洗脫參數如表1所示。

表1 梯度洗脫參數Table 1 Parameters for procedure of gradient elution

1.2.2 MS/MS條件 電噴霧離子源(ESI);正離子掃描模式，駐留時間500ms;多反應監測模式(MRM);離子源溫度120℃，脫溶劑溫度350℃;進樣錐電壓20V，毛細管電壓3.00kV;脫溶劑氣和錐孔氣為氮氣，脫溶劑氣流速500L/h，錐孔氣流速50L/h，碰撞氣體為氬氣。

1.2.3 樣品處理 從上海市15個不同的油條加工點(包括市場上普通的早餐攤點A和四種品牌的連鎖餐飲店B、C、D、E各3個加工點)采集油條樣品，樣品經真空干燥后粉碎混勻。參考 Niquet－Léridon等［12］的研究進行樣品前處理。稱取0.5g粉末狀樣品，加入2mL硼酸鈉緩沖液(0.2mol/L，pH 9.2)和0.4mL硼氫化鈉溶液(2mol/L，含0.1mol/L氫氧化鈉)，混勻后在－4℃冰箱中放置8h進行還原反應。根據 Folch 法［15］，加入4mL 三氯甲烷－甲醇(2∶1，v∶v)溶液除去油條樣品中的油脂，同時使蛋白質沉淀。5000r/min離心10min后，在沉淀物中加入4mL鹽酸溶液(6mol/L)，在110℃條件下酸解24h。酸解液經真空干燥，用4mL超純水再溶解后，取1mL再溶解溶液用水定容至50mL(添加內標物D4－CML，使其在最終樣品溶液中濃度為100μg/L)。用3mL甲醇和3mL水分別洗凈和活化MCX小柱，取2mL上述添加D4－CML的樣品溶液過柱，依次用3mL水和3mL甲醇洗凈雜質后，用5mL含5%氨水的甲醇溶液洗脫，收集的洗脫液經氮吹濃縮后，重新溶解在2mL甲醇－水(80∶20，v∶v)溶液中，得到最終樣品溶液，取適量此溶液過0.22μm有機相濾膜后，用于HPLC－MS/MS分析。

根據 GB 5009.5－2010 食品中蛋白質的測定［16］，采用凱氏定氮法對油條中的蛋白質進行定量。

2 結果與討論

2.1 固相萃取凈化小柱的選擇

比較了C18SPE小柱、酸性氧化鋁小柱、SCX和MCX陽離子交換柱四種固相萃取小柱對加標提取液的保留和凈化效果。C18小柱不能將CML完全保留住，在上樣流出液(應棄去部分)中檢測出CML和D4－CML;酸性氧化鋁小柱凈化后，CML被保留在小柱內不能流出;而經SCX和MCX陽離子交換柱凈化后，兩者的回收率都接近100%，但MCX陽離子交換小柱對提取液的凈化效果較SCX陽離子交換小柱好。因此，本方法采用MCX陽離子交換柱凈化。

2.2 液相色譜柱的選擇

比較了C18色譜柱和HILIC色譜柱對CML的保留效果。在不使用離子對試劑的前提條件下，用5%甲醇(含2mmol/L乙酸銨和0.1%甲酸)－95%水(含2mmol/L乙酸銨和0.1%甲酸)作為流動相，使用C18色譜柱進樣(100μg/L CML標準溶液)分析;用80%甲醇(含2mmol/L乙酸銨和0.1%甲酸)－20%水(含2mmol/L乙酸銨和0.1%甲酸)作為流動相，使用HILIC色譜柱進樣(100μg/L CML標準溶液)分析;結果如圖2、3所示，在C18柱中，CML的保留時間僅為1.21min，而在HILIC柱中的保留時間為3.47min。因此選用HILIC色譜柱可以不使用離子對試劑，能達到有效的保留CML，使其與雜質完全分離。

圖1 使用C18色譜柱時CML(100μg/L)的總離子流色譜圖Fig.1 Total ion spectrum of CML using C18column

圖2 使用HILIC柱時CML(100μg/L)的總離子流色譜圖Fig.2 Total ion spectrum of CML using HILIC column

2.3 流動相的選擇

選擇CML標準溶液(100μg/L)進樣，通過實驗比較了流動相甲醇－水和流動相乙腈－水對CML的洗脫效果，結果表明甲醇作為有機相時，CML的峰形更尖銳，因此流動相選擇了甲醇和水。沒有添加乙酸銨和甲酸時，CML不出峰或者色譜峰拖尾嚴重，可能是由于標準溶液和樣品溶液pH的差異較大所致。在甲醇和水相中分別添加了2mmol/L乙酸銨和0.1%甲酸，提高了離子化效率，改善了峰形，提高了靈敏度，從而降低了檢測限。實驗還討論了不同的流動相比例對CML保留時間和峰形的影響，分別選取了90%、80%、50%三個甲醇濃度作為流動相。結果在確保色譜柱對CML的保留效果的同時，80%甲醇濃度得到的CML峰形最優，響應最強。在此基礎上，為了增強CML與雜質的分離效果，經過實驗優化采取了梯度洗脫程序(見表1)。

2.4 質譜條件的優化

對CML進行二級質譜掃描，CML母離子m/z 205.4主要被打碎成m/z 130.2，m/z 83.8兩類離子碎片，這與文獻報道一致［11－14］。本方法采用 m/z 130.2為定量離子，CML的二級質譜圖見圖3。

圖3 CML的二級質譜圖Fig.3 MS/MS fragments of CML

對錐孔電壓、碰撞能量、駐留時間進行了優化，CML和D4－CML優化后的質譜條件見表2。

表2 MRM模式下CML和D4－CML的質譜參數Table 2 Mass parameters in multiple reaction monitoring(MRM)mode for CML and D4－CML

2.5 方法學驗證

2.5.1 儀器檢出限 配制成CML濃度分別為0、1、10、50、100μg/L的標準溶液(其中內標 D4－CML 濃度均為10μg/L)。經HPLC－MS/MS檢測，得到CML和D4－CML混合標準溶液的MRM色譜圖(圖4)，D4－CML和CML的保留時間均為3.47min。分別以S/N=3和S/N=10的計算方法得出儀器檢出限(LOD)為1μg/L，定量限(LOQ)為 3μg/L，表明本方法具有較高的靈敏度。

2.5.2 添加回收率和精密度 向油條酸解液中添加CML和D4－CML標準溶液，使加標量分別為10、20、100μg/kg。每個添加濃度平行測定6次(n=6)。見表3，添加回收率為89.5%～99.1%，相對標準偏差為2.1%～2.6%，回收率和精密度較高。由于油條中CML含量較高，將樣品稀釋了200倍后(與添加CML濃度相當)進行添加回收實驗，樣品基質也得到了稀釋，因而基質效應小，定量準確度高。

2.6 油條中CML含量的測定

采集市場上15個不同加工點(包括市場上普通的早餐攤點A和四種品牌的連鎖餐飲店B、C、D、E)的油條經樣品處理后，用已建立的HPLC－MS/MS法進行CML含量測定。每個樣品平行測定三次(n=3)，測得15種不同油條樣品中的蛋白質和CML含量見表4。油條中CML含量范圍為5.3±0.5～15.4±0.3mg/(kg樣品)，也可以用油條中蛋白質含量來表示為69.3±8.2～182.2±3.1mg/(kg蛋白質)。

圖4 CML和D4－CML混合標準溶液的MRM色譜圖Fig.4 MRM chromatogram of CML and D4－CML mixed standard solution

由表中數據可以看出，不同來源的油條樣品中CML含量有所差異;市場上普通早餐攤點的油條中CML含量稍高于四個不同品牌連鎖店的油條;四個不同品牌連鎖店之間的油條中CML含量有較大差異。蛋白質含量高的樣品中CML含量相對較高，不同的油條加工點對油炸溫度和油炸時間的控制上的差異也會導致美拉德反應程度的不同，因而使晚期糖基化終末產物中CML的產生量有所不同。

表3 油條中CML的添加回收實驗結果(n=6)Table 3 Recovery rate of CML in fried bread sticks(n=6)

3 結論

本研究對食品中CML的提取方法進行了優化，樣品處理無需衍生化;利用MCX固相萃取小柱凈化和HILIC色譜柱對強極性的CML進行分離，無需使用離子對試劑即可得到有效保留;建立的HPLCMS/MS CML檢測法成功地應用于具有中國特色的油炸食品(油條)的檢測中。本方法操作簡便、快速、準確度高、靈敏度好，為進一步研究不同種類食品中CML含量的檢測、研究食品加工過程中影響CML的產生因素以及研究CML與人類疾病(糖尿病、尿毒癥、動脈粥樣硬化等)的關系奠定基礎，進而為指導人們改進食品加工工藝提供依據。

表4 15種不同來源油條樣品中CML含量和蛋白質含量(n=3)Table 4 CML content and protein content in 15 different source fried bread sticks(n=3)

［1］Bengmark，S.Advanced glycation and lipoxidation end products－amplifiers of inflammation:The role of food［J］.Journal of Parenteral and Enteral Nutrition，2007，31(5):430－440.

［2］Somoza V，Wenzel E，Weiss C，et al.Dose－ Dependent utilisation ofcasein－linked lysinoalanine，N(epsilon)－fructoselysine and Nε－ carboxymethyllysine in rats［J］.Molecular Nutrition ＆ Food Research，2006，50:833－841.

［3］Wang Z Q，Jiang Y C，Liu N F，et al.Advanced glycation end－product Nε－carboxymethyl－Lysine accelerates progression of atherosclerotic calcification in diabetes［J］.Atherosclerosis，2012，221:387－396.

［4］馮建勛，李紅艷，田建偉.飲食中晚期糖基化終產物對健康SD大鼠腎臟的影響［J］.中國臨床康復，2006，10(36):116－119.

［5］Hartkopf J，Pahlke C，Liidemann G，et al.Determination of Nε－carboxy－methyllysine by a reversed－phase high－performance liquid chromatography method［J］.Journal of Chromatography A，1994，672:242－246.

［6］許良元，朱靈，張龍，等.晚期糖基化終末產物熒光光譜測量系統的設計［J］.光譜學與光譜分析，2009，29(8):2298－2301.

［7］Goldberg T，Cai W，Peppa M，et al.Advanced glycoxidation end products in commonly consumed foods［J］.Journal of the American Dietetic Association，2004，104(8):1287－1290.

［8］Uribarri J，Woodruff S，Goodman S，et al.Advanced Glycation End Products in Foods and a Practical Guide to Their Reduction in the Diet［J］.Journal of the American Dietetic Association，2010，110:911－916.

［9］Drusch S，Faist V，Erbersdobler H F.Determination of Nεcarboxymethyllysine in milk products by amodified reversedphase HPLC method［J］.Food Chemistry，1999，65:547－553.

［10］Charissou A，Ait－Ameur L，Birlouez－Aragon I.Evaluation of a gas chromatography/mass spectrometry method for the quantification of carboxymethyllysine in food samples［J］.Journal of Chromatography A，2007，1140:189－194.

［11］Assar S H，Moloney C，Lima M，et al.Determination of Nε－(carboxymethyl)lysine in food systems by ultra performance liquid chromatography － mass spectrometry［J］.Amino Acids，2009，36(2):317－326.

［12］Niquet － Léridon C，Tessier F J.Quantification of Nε－carboxymethyl(lysine)in selected chocolate－flavoured drink mixes using high－performance liquid chromatography－linear ion trap tandem mass spectrometry［J］.Food Chemistry，2011，126:655－663.

［13］Hull G L J，Woodside J V，Ames J M，et al.Nε－(carboxymethyl)lysine content of foods commonly consumed in a Western style diet［J］.Food Chemistry，2012，131:170－174.

［14］Zhang G，Huang G W，Lu X，et al.Determination of Advanced Glycation Endproducts by LC－MS/MS in Raw and Roasted Almonds(Prunus dulcis)［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2011，59:12037－12046.

［15］Folch J，Less M，Stanley G H S.A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues［J］.Journal of Biological Chemistry，1957，226:497－509.

［16］食品安全國家標準 食品中蛋白質的測定.中華人民共和國國家標準.GB 5009.5－2010.