重組旋毛蟲蛋白rTsP38對小鼠腸缺血/再灌注腸損傷的保護作用及機制研究

劉衛(wèi)鋒，溫仕宏，李云勝，沈建通，劉克玄

（中山大學附屬第一醫(yī)院麻醉科，廣州廣東 510080）

腸I/R損傷是臨床常見現象，死亡率高［1］。巨噬細胞在腸I/R損傷中起重要作用［2-5］。針對腸巨噬細胞的干預措施，有可能成為腸I/R損傷的有效防治手段。巨噬細胞主要可分為M1和M2型巨噬細胞。研究發(fā)現，在腦、腎、心臟等I/R損傷中，M1向M2的轉變，能減輕組織損傷，促進組織修復［6-7］。宿主腸道寄生蟲感染，能夠促進Th2型細胞因子生成、激活M2型巨噬細胞，減輕宿主并存的免疫相關疾病［8-9］。前期研究已證實重組旋毛蟲蛋白rTsP38引起小鼠Th2型免疫反應，在M1和M2型巨噬細胞的激活或轉變方面可能有調控作用［10］。

本研究擬建立小鼠腸I/R腸黏膜損傷的模型，觀察rTsP38對小鼠腸I/R損傷的保護效應，并觀察腸I/R損傷對腸黏膜巨噬細胞分型的影響，以及rTsP38對腸黏膜巨噬細胞分型轉變的影響。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑 正立顯微成像系統(tǒng)（Leica公司，德國），ELX800酶標儀（Biotek公司，美國），PTC240PCR儀（Bio-Rad公司，美國），弗氏佐劑（Sigma公司，美國），HRP-山羊抗兔 IgG（Jackson公司，美國），兔抗小鼠CD163抗體（Epitomics公司，美國），兔抗小鼠MPO抗體（BioGenex公司，美國），兔抗小鼠Ki-67抗體（Dako公司，丹麥），TRIzol提取液（Bio-Rad公司，美國），Taq聚合酶（TaKaRa公司，日本），Real-time PCR試劑盒（TOYOBO公司，日本）。

1.2 動物模型制備 SPF級♂ BALB/c小鼠120只，購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心。術前禁食12h，自由飲水。參照本課題組前期研究方法復制腸I/R損傷模型［11］。小鼠麻醉采用七氟烷，經小動物麻醉機面罩誘導，新鮮氣體流量2 L·min-1，吸入濃度5%，維持2%～3%。常規(guī)消毒，經腹正中切口，分離腸系膜上動脈（superiormesenteric artery，SMA）后用無創(chuàng)微動脈夾夾閉，縫合切口，60min后經原切口進腹，松開微動脈夾，恢復血供，縫合傷口并消毒，術后自由進食食物和水。

1.3 實驗分組與免疫 如Fig 1所示，上述動物隨機分為4組：假手術組（S組）：僅行開腹，分離SMA但不夾閉；腸I/R損傷組（I組）：分離SMA，微動脈夾夾閉之后縫合切口，60min后經原切口進腹，松開動脈夾，恢復血流進行再灌注；（3）rTsP38免疫組（T組）：操作同I/R組；（4）佐劑免疫組（A組）：操作同I/R組。免疫方案：建立I/R模型前6周，予小鼠背部皮下多點注射下述試劑，共3次，每次間隔14 d。S組予 PBS 0.2 ml，I組處理同 S組，T組予rTsP38 0.2 ml（含25μg與等體積弗氏完全或不完全佐劑乳化混勻的rTsP38），A組予0.1 ml PBS＋0.1 ml弗氏完全或不完全佐劑乳化混勻的混合液。

Fig 1 Experimental protocols

1.4 實驗取材 于建立小鼠腸I/R損傷模型前，尾靜脈采血，低溫離心，分離血清，放進-80℃冰箱保存，用于rTsP38引起的抗體滴度測定。再灌注2 h（每組10只小鼠）和7 d（每組20只小鼠）后，于深麻醉下斷頸處死實驗動物。距回腸末端5 cm處相同部位取一約3 cm腸段，除去外膜脂肪組織，平均分為兩段。其中一段置于4%多聚甲醛固定12 h，常規(guī)石臘切片，用于病理學檢測。另一段小腸用4℃PBS溶液沖洗后，置于-80℃低溫冰箱保存，用于細胞因子和巨噬細胞標志物檢測。

1.5 rTsP38引起的小鼠血清抗體滴度測定 于建立小鼠腸I/R損傷模型前，尾靜脈采血，室溫放置4 h，冰上放置30～60 min，吸出已析出的血清，2 700×g離心沉淀后，再析出分離的血清，然后10 000×g瞬時離心去除少量紅細胞，采用間接ELISA法，按說明書檢測小鼠血清抗體滴度變化。

1.6 再灌注后小鼠進食量和體重變化 測量并記錄再灌注7 d組存活小鼠每日進食量及再灌注1、2、4及7 d體重變化情況。

1.7 腸黏膜損傷和修復的評價 常規(guī)石蠟切片，HE染色。在光學顯微鏡下觀察2 h組小鼠小腸黏膜形態(tài)學變化，采用改良Chiu′s評分法評價腸黏膜損傷程度，評分越高，表明損傷越嚴重［12］。在正立顯微成像系統(tǒng)下，觀察7 d組小鼠小腸絨毛恢復情況，隨機選取8～10個絨毛并測量其絨毛頂端至隱窩的高度。

1.8 qRT-PCR法測定小鼠小腸組織IL-6、IL-10和巨噬細胞標志物NOS2（M 1型巨噬細胞）、Arg-1（M 2型巨噬細胞） 取100 mg小腸組織，采用Trizol一步法提取小腸組織總RNA，并于260 nm和280 nm處測定其OD值，計算OD260/OD280值。以βactin為內參，半定量qRT-PCR法檢測 IL-6、IL-10、NOS2和Arg-1 mRNA表達水平。引物設計見Tab 1。

Tab 1 PCR primer design

1.9 小腸組織M 2巨噬細胞標志物CD163、中性粒細胞MPO和增殖細胞K i-67表達檢測 常規(guī)脫蠟水化后，采用Envision免疫組織化學法測定小腸組織M2巨噬細胞標志物CD163、中性粒細胞MPO和增殖細胞Ki-67表達變化。

1.10 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件分析數據，計量資料以ˉx±s表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Tukey post hoc檢驗。

2 結果

2.1 小鼠血清抗體滴度變化 rTsP38免疫后小鼠血清IgG1水平明顯升高，與S組、I組和A組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。rTsP38免疫后小鼠血清IgG2a水平也明顯升高，與S組、I組和A組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），但IgG2a升高的倍數明顯低于IgG1升高的倍數，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01，Fig 2）。

Fig 2 Serological antibody response to rTsP38 immunization in m ice（±s）*P＜0.05，**P＜0.01 vs group S，Iand A；＃＃P＜0.01 vs IgG2a

2.2 小鼠進食量和體重變化 再灌注后1 d，I組、T組和A組小鼠進食量明顯少于S組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。T組小鼠于再灌注后2 d進食量明顯增加，與S組比較，差異無統(tǒng)計學意義。再灌注后2～7 d，T組小鼠進食量明顯高于I組和A組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，Fig 3A）。

再灌注后1、2和4 d，I組、T組和A組小鼠體重增加明顯低于S組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。與Ⅰ組和A組比較，T組小鼠于再灌注后4 d和7 d體重明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，Fig 3B）。

Fig 3 Daily food intake and body weight change after intestinal ischem ia/reperfusion（I/R）（±s，n＝7-10）*P＜0.05，**P＜0.01 vs group Iand A；＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs group I，T and A

Fig 4 Histopathological changes of intestinalmucosa and the evaluation of intestinal injury with modified Chiu′s scores under lightm icroscopy（hematoxylin and eosin staining，magnification：×200，ˉx±s）A，B，C，D represent group S，I，T and A.（n＝9-10，＃P＜0.05 vs group Iand A；**P＜0.01 vs group S）

2.3 小鼠小腸組織光學顯微鏡下形態(tài)學及改良Chiu′s評分變化 光鏡下可見S組小腸黏膜組織完整。與S組比較，I組、T組和A組小鼠的小腸組織改良Chiu′s評分均升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。T組小鼠的小腸組織改良Chiu′s評分明顯低于I組和A組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，Fig 4）。

再灌注后7 d，T組小鼠小腸絨毛高度明顯高于S組、I組和A組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01，Fig 5）。與S組、I組和A組相比較，T組小鼠小腸絨毛高度增長了17%～23%。

2.4 小鼠小腸組織IL-6、IL-10和巨噬細胞標志物NOS2（M 1型巨噬細胞）、Arg-1（M 2型巨噬細胞）的表達變化

2.4.1 小鼠小腸組織IL-6表達變化 再灌注后2 h，S組、I組和A組小鼠小腸組織IL-6基因表達變化差異無統(tǒng)計學意義，而T組小鼠小腸組織IL-6基因表達明顯高于S組、I組和A組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。再灌注后7 d，I組、T組和A組小鼠小腸組織IL-6基因表達明顯高于S組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或 P＜0.01，Fig 6A）。與再灌注后2 h比較，I組、T組和A組小鼠小腸組織IL-6基因表達分別升高了2.5、14.8和2.6倍。

2.4.2 小鼠小腸組織IL-10表達變化 再灌注后2 h，I組、T組和A組小鼠小腸組織IL-10基因表達明顯高于S組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。再灌注后7 d，I組和A組小鼠小腸組織IL-10基因表達回落，與S組比較，差異無統(tǒng)計學意義；而T組小鼠小腸組織IL-10基因表達明顯升高，與S組、I組和A組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01，Fig 6B）。與再灌注后2 h比較，I組、T組和A組小鼠小腸組織IL-10基因表達分別升高了0.2、317.3和0.2倍。

2.4.3 小鼠小腸組織NOS2表達變化 再灌注后2 h，S組、I組、T組和A組小鼠小腸組織NOS2基因表達變化差異無統(tǒng)計學意義。再灌注后7 d，I組、T組和A組小鼠小腸組織NOS2基因表達明顯高于S組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），T組小鼠小腸組織NOS2基因表達明顯高于I組和A組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01，Fig 6C）。與再灌注后2 h比較，I組、T組和A組小鼠小腸組織NOS2基因表達分別升高了3.1、7.4和4.0倍。

Fig 5 Changes in villus height of intestinalmucosa（hematoxylin and eosin staining，magnification：×200，±s，n＝7-10）**P＜0.01 vs group S，Iand A

Fig 6 Changes of cytokines，Arg-1，and NOS2 mRNA levels in intestine at different reperfusions（±s，n＝5-6）A，B，represent IL-6 and IL-10 mRNA levels in intestine，respectively.C，D，denote Arg-1 and NOS2 mRNA levels in intestine，respectively.**P＜0.01 vs groups Iand A；＃＃P＜0.01 vs group S；ΔΔP＜0.01 vs groups S，Iand A；□P＜0.05，□□P＜0.01 vs2 h

2.4.4 小鼠小腸組織Arg-1表達變化 再灌注后2 h，S組、I組、T組和A組小鼠小腸組織Arg-1基因表達變化差異無統(tǒng)計學意義。再灌注后7 d，T組小鼠小腸組織Arg-1基因表達明顯升高，與S組、I組和A組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01，Fig 6D）。與再灌注后2 h比較，I組、T組和A組小鼠小腸組織Arg-1基因表達分別升高了0.7、134.9和1.4倍。

2.5 免疫組化測定小腸組織M 2巨噬細胞標志物CD163、中性粒細胞MPO和增殖細胞Ki-67表達的變化

2.5.1 CD163免疫組化測定 再灌注后2 h和7 d，T組小鼠小腸組織CD163陽性細胞數較S組、I組和A組明顯增多，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或 P＜0.01，Fig 7）。

2.5.2 MPO免疫組化測定 再灌注后2 h，S組和T組小鼠小腸組織可見少量MPO陽性細胞，I組和A組明顯增多，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。再灌注后7 d，S組、I組、T組和A組小鼠小腸組織MPO陽性細胞數回落，但I組和A組MPO陽性細胞數仍明顯高于T組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，Fig 8）。

2.5.3 Ki-67免疫組化測定 再灌注后2 h，T組小鼠小腸組織Ki-67陽性細胞數較I組和A組明顯增多，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。再灌注后7 d，Ki-67陽性細胞數回落，但T組小鼠小腸組織Ki-67陽性細胞數明顯高于S組、I組和A組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01，Fig 9）。

Fig 7 Changes of CD163-positive cells in intestine at different reperfusions（ˉx±s，n＝5）*P＜0.05，**P＜0.01 vs group S；＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs groups S，Iand A；ΔΔP＜0.01 vs2 h

3 討論

本研究中，再灌注后2 h，I組小鼠Arg-1（M2型巨噬細胞標志物）和NOS2（M1型巨噬細胞標志物）mRNA水平均升高，7 d時Arg-1水平下降，NOS2水平明顯升高；與Arg-1和NOS2 mRNA水平變化趨勢相似，再灌注后2 h，I組小鼠IL-10和IL-6 mRNA水平均升高，7 d時IL-10水平下降，IL-6水平明顯升高。上述結果提示，腸I/R損傷在再灌注早期促進巨噬細胞激活，在后期促進M2向M1型巨噬細胞的轉變。Kigerl等［13］在小鼠脊髓I/R損傷的研究中也有類似發(fā)現。

M1和M2型巨噬細胞在組織損傷和修復中的作用至關重要。M1向M2型巨噬細胞的轉變，對于炎癥的恢復具有重要意義。本研究中，rTsP38免疫后T組小鼠血清IgG1水平明顯升高，雖然IgG2a也有所升高，但明顯低于IgG1水平。與I組小鼠比較，再灌注后7 d，T組小鼠Arg-1和NOS2 mRNA水平均升高，但以Arg-1升高為主（135倍 vs 7倍），CD163＋細胞數明顯增多；與Arg-1和 NOS2 mRNA水平變化趨勢相似，再灌注后7 d，T組小鼠IL-10和IL-6 mRNA水平均較I組小鼠升高，但以IL-10升高為主（317倍 vs 15倍）。上述結果表明，rTsP38具有很好的免疫原性，并引起宿主偏向Th2型的免疫反應，激活巨噬細胞，并促進了M1向M2型巨噬細胞的轉變。

已有研究表明，在腦、腎、心臟等I/R損傷中，M1向M2巨噬細胞的轉變，能減輕組織損傷，促進組織修復［6-7］。本研究發(fā)現，與I組和A組比較，T組小鼠再灌注后2 h，腸黏膜損傷明顯減輕，改良Chiu′s評分明顯降低；再灌注后7 d，T組小鼠小腸絨毛高度較其余各組明顯增加；此外，T組小鼠進食量、體重變化以及增殖細胞數均明顯增加，中性粒細胞浸潤明顯減少。上述結果表明rTsP38通過促進M1向M2型巨噬細胞的轉變，從而減輕腸I/R損傷、促進腸修復和小鼠腸功能恢復。

綜上所述，腸I/R激活巨噬細胞并促進M2向M1型巨噬細胞轉變；rTsP38促進Th2型免疫反應，逆轉腸I/R損傷所致M2向M1型巨噬細胞的轉變，并促進M1向M2型巨噬細胞轉變，從而減輕小鼠腸I/R所致腸損傷，促進腸黏膜修復和腸功能恢復。

Fig 8 Changes of MPO-positive cells in intestine at different reperfusions（±s，n＝5）ΔP＜0.05 vs group T；**P＜0.01 vs group S；＃＃P＜0.01 vs groups S and T.

Fig 9 Changes of K i-67-positive cells inintestine at different reperfusions±s，n＝5）＃P＜0.05 vs groups Iand A；**P＜0.01 vs groups S，Iand A

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