水楊酸鈉對大鼠海馬神經元電壓門控性鈣離子通道的影響

朱小麗，劉硯星，種寶貴，馬紅芳，江 平，張曉燕

（1.河北醫科大學藥理學教研室，河北省新藥藥理毒理研究重點實驗室，河北石家莊 050017；2.河北省哈勵遜國際和平醫院，河北衡水 053000）

耳鳴是一種常見的聽覺系統疾病，其特點是在無外部相應聲源的情況下耳內出現的幽靈般的鈴音或蜂鳴聲，是一種主觀的聲音感覺［1］。大量研究顯示水楊酸鈉會導致耳鳴［2-4］，因此水楊酸鈉成為研究耳鳴發生機制的重要工具藥。Liu等［5］通過觀察水楊酸鈉對顳皮層上延遲整流鉀離子通道的影響，證實了耳鳴與聽覺中樞有關。耳鳴通常伴隨失眠、厭煩等不良情緒，許多臨床醫生已經注意到了耳鳴和情緒狀態之間的聯系［6］。影像學研究已證實，耳鳴和抑郁癥之間存在激活的神經回路，噪音創傷后耳鳴的動物模型和抑郁癥的動物模型都伴有海馬神經元的損傷［7］。實際上認知行為療法對某些耳鳴患者是有效的［8］。這些耳鳴和情緒反應之間的聯系使一些學者提出邊緣系統參與耳鳴不良情緒的形成這一觀點［9］。Mirz等［10］利用 PET技術對 8名耳鳴患者和8名健康志愿者進行對比，發現患者的右前額葉、右顳葉腦區的腦血流量明顯增加，同時左半腦區的邊緣系統的杏仁核部位的腦血流量也有所增加。同時，Mirz等［11］還對12名健康志愿者進行研究，利用噪音來模擬耳鳴的心理聲學特征及其對患者造成的情感反應，再利用PET檢測大腦局部血流分布的改變。該研究發現這些聲音刺激引起初級聽皮層、次級聽皮層、背外側額葉以及與情感相關的邊緣系統腦血流的增加，證明邊緣系統可能與耳鳴的感知和情緒產生有關。Lockwood等［12］應用PET研究大腦的代謝活動，通過觀察大腦對去氧葡萄糖的攝取情況，發現耳鳴患者不僅Brodmann41區域（即原始聽區域）的代謝活動增強，邊緣系統也出現異常的代謝活動，聽覺系統和邊緣系統間存在著異常構成聯系，耳鳴與顳橫回、顳上回、顳下回及海馬等腦區的活動有關。同時，他還用15O標記的H215O作為示蹤劑，通過PET觀察了4例均能通過口面隨意運 動 （performing voluntary oral facial movements，OFM）改變耳鳴響度的耳鳴患者，在其靜息狀態、口面活動期間及給予聲音信號時的腦血流變化，發現耳鳴響度增加時對側聽皮層腦血流增加，而且聲音信號在耳鳴患者腦內引起腦活動的區域比正常人更廣泛，它包括初級聽皮層、島葉、海馬、邊緣系統、丘腦等，同時還觀察到聽覺系統與海馬存在著異常聯系，為邊緣系統參加耳鳴感覺形成的推論提供了依據［12］。有研究顯示興奮性神經遞質谷氨酸［12］和抑制性神經遞質γ-氨基丁酸［13］與耳鳴的形成關系密切，而電壓門控性鈣通道（voltage-gated calcium channels，VGCC）與神經遞質釋放及激素分泌密切相關［11］。所以，本研究利用腦片膜片鉗技術，觀察水楊酸鈉對大鼠海馬神經元電壓門控性鈣離子通道電生理學特性的影響。

1 材料與方法

1.1 腦片制備 選用健康14 d齡的SD大鼠，快速斷頭，掀開顱骨，完全斷開腦神經，完整剝離出全腦，使腦組織在0～4℃預先氧飽和（95%O2＋5%CO2）的人工腦脊液（artificial cerebrospinal fluid，ACSF）中冷卻。按冠狀切面修整剝離出的全腦，用濾紙吸干表面的ACSF，用氰丙烯酸鹽膠垂直粘在切片機上已事先固定好的瓊脂制標本托上。將標本槽快速充滿0～4℃預先氧飽和（95%O2＋5%CO2）的ACSF，使全腦浸埋其中，并持續通氣。將其用振動切片機切成300μm厚的腦片，然后將腦片移至孵育槽內，持續通氣，在溫度為（30～32）℃下，孵育1 h。

ACSF：NaCl 119， MgCl21.3， KCl 5.4，NaH2PO4·2H2O 1，NaHCO326.2，D-Glucose 11，CaCl22.5，濃度單位為 mmol·L-1，pH值調節至7.35～7.40，并用0.22μm孔徑的微孔濾膜濾過。

1.2 全細胞膜片鉗記錄 將孵育好的腦片置于灌流槽中，浸沒于液面下約3～4 mm。用蓋網固定法固定腦片，用氧飽和的標準細胞外液進行持續灌流，流速約為3 ml·min-1。利用紅外微分干涉相差顯微鏡，通過圖像采集軟件成像于計算機監視器屏幕上，觀察并選擇狀態良好的海馬神經元進行實驗。將硬質有芯玻璃毛坯管拉制成電阻為4～6Ω的玻璃微電極，從微電極尾部充灌電極內液，然后通過微電極操縱器引導電極到達記錄部位，到達記錄部位后釋放正壓、給予負壓，形成高阻抗（＞1 GΩ）封接，再繼續施以負壓吸破細胞膜，形成全細胞記錄模式。

ICa的標準細胞外液：TEA 140，CsCl 5，HEPES 10，D-Glucose 11，BaCl25，MgCl21，TTX 0.01.濃度單位均為mmol·L-1，將pH值調至7.35，并用孔徑為0.22μm的微孔濾膜濾過。

ICa的電極內液：CsCl 110，HEPES 10，EGTA 10，TEA 30，Mg-ATP 5，Na-GTP 0.3，濃度單位均為mmol·L-1，將pH值調至7.2，并用孔徑為0.22 μm的微孔濾膜濾過。

1.3 給藥方式 以標準細胞外液為溶媒，配制不同濃度的水楊酸鈉溶液。采取灌流方式給藥。

1.4 數據處理和統計分析 采用EPC-10軟件（HECK公司）收集所有的實驗數據，采用Origin 7.5軟件分析數據。實驗數據用ˉx±s表示。采用配對t檢驗進行兩組數據間的比較。

2 結果

2.1 水楊酸鈉對海馬神經元鈣電流的抑制作用鉗制電壓-50 mV，給以10 mV持續200 ms的去極化脈沖得到的電流即ICa。采用灌流法給予不同濃度（分別為 0.1、0.3、1、3、10 mmol·L-1）的水楊酸鈉，觀察水楊酸鈉對ICa的影響。以水楊酸鈉作用的效應率為縱坐標，水楊酸鈉的濃度為橫坐標作圖，得到濃度 -效應關系曲線（Fig 1）。加入0.1、0.3、1、3、10 mmol·L-1的水楊酸鈉后，ICa幅度分別減小為加藥前的（94.56±1.07）%、（84.48±1.02）%、（63.39±1.37）%、（40.47±3.57）%、（23.42 ±3.90）%。按照Hill方程對濃度-效應關系進行擬合。擬合后的濃度-效應曲線的半抑制濃度IC50為1.64 mmol·L-1，Hill系數h為0.22。實驗結果表明，水楊酸鈉對ICa有抑制作用，而且這種抑制作用具有劑量/濃度依賴性。本實驗的水楊酸鈉的實驗濃度選為1 mmol·L-1。

Fig 1 Dose response inhibition of sodium salicylate on I Ca

Fig 2 Effect of 1mmol·L－1 salicylate on the I-V relationship of peak I CaA：Original current traces of control I Ca；B：Original current traces of I Ca after 1 mmol·L-1 salicylate application；C：Peak I-V curves for control and 1 mmol·L-1 salicylate.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control.

Fig 3 Effect of 1 mmol·L－1 salicylate on the steady-state activation curve of I Ca

鉗制電壓-50 mV，給以 -50～＋40 mV持續200 ms，階躍為10mV的一系列去極化測試脈沖，刺激頻率為0.1 Hz，可以記錄到一系列ICa。

以電流的峰值/膜電容（pA/pF）為縱坐標，以相對應的電壓為橫坐標作圖，即得到ICa的電流密度-電壓曲線。Fig 2A和 Fig 2B分別顯示給藥前和給藥后的原始電流圖。Fig 2C顯示1 mmol·L-1水楊酸鈉使ICa的幅度減小，對其有抑制作用。而且，加藥前，ICa在-50 mV左右開始激活，在-30 mV到達到峰值，然后逐漸減小，到＋25 mV翻轉成外向電流。給藥后，ICa也是在-50 mV左右開始激活，在-40 mV左右達到峰值，然后逐漸減小，到＋25 mV翻轉成外向電流。從實驗數據得到1 mmol·L-1水楊酸鈉使ICa的I-V曲線的峰值電壓向超級化方向移動10 mV，但是不改變其翻轉電位。

2.2 水楊酸鈉對海馬神經元鈣電流的穩態激活曲線的影響 鉗制電壓-50 mV，給以-50～-10 mV，持續200 ms，階躍為10 mV的一系列去極化脈沖，刺激頻率為0.1 Hz。將每次電流的峰值轉化為電導值，以歸一化的電導值為縱坐標，相對應的膜電位為橫坐標，作圖。用最小二乘法，按照Boltzmann方程進行曲線擬合。得到穩態激活曲線（Fig 3）。在加藥前半激活電壓V1/2為（-23.52±0.50）mV，斜率k為（2.43±0.29）。給藥后半激活電壓V1/2為（-32.19±1.45）mV（P＜0.05，n＝8），斜率k為（2.30±1.31）（P＞0.05，n＝8）。實驗結果表明，1 mmol·L-1水楊酸鈉使ICa的穩態激活曲線向超極化方向移動大約9 mV，但是曲線的斜率并不改變。

2.3 水楊酸鈉對海馬神經元穩態失活曲線的影響鉗制電壓 -50 mV，給以 -70～＋10 mV，持續2 000 ms，階躍為10 mV的一系列條件脈沖，然后給予去極化至＋10 mV，持續200 ms的測試脈沖，刺激頻率為0.1 Hz。以電流峰值的相對值（I／Imax）為縱坐標，相對應的條件脈沖為橫坐標作圖，再利用最小二乘法，按照Boltzmann方程進行擬合，得到ICa的穩態失活曲線（Fig 4）。加藥前，半失活電壓 V1/2為（-23.71±1.21）mV，斜率 k為（8.35±1.14）；給藥后，半失活電壓 V1/2為（23.08±0.71）mV（P＞0.05，n＝8），斜率 k為（9.43±0.68）（P＞0.05，n＝8）。實驗結果表明，1 mmol·L-1水楊酸鈉既不使ICa的穩態失活曲線向去極化方向移動，也不向超極化方向移動，也不改變其斜率。

3 討論

鈣電流是細胞動作電位的重要電流，在形成動作電位的平臺期方面起重要作用。VGCC開放，大量Ca2＋內流使神經遞質釋放增多［13］。實驗結果表明，水楊酸鈉對ICa有抑制作用，且這種作用具有濃度依賴性。Taggart［14］在研究水楊酸鈉的安全用藥劑量時發現，水楊酸鈉導致耳鳴的發病率與水楊酸鈉的血藥濃度成正比，本實驗結果與他的研究結論一致。本實驗還顯示，1 mmol·L-1水楊酸鈉會改變ICa的激活動力學特征，使ICa的穩態激活曲線向超級化方向移動大約9 mV，但是不改變其失活動力學特征。水楊酸鈉的抑制作用可能是因為它能與海馬部位神經元上的VGCC的靜息態和激活態相結合。

Brozoski等［15］用高分辨率質子磁共振波譜技術觀察噪音導致耳鳴的大鼠，發現下丘和聽皮層的興奮性神經遞質谷氨酸含量增多，而抑制性神經遞質γ-氨基丁酸含量減少。Liu等［16］利用微透析技術觀察到水楊酸鈉使豚鼠下丘和顳皮層的葡萄糖和乳酸含量增高，同時觀察到5-羥色胺含量也增高。大鼠暴露在噪音中4個月后，檢測到甘氨酸受體β亞基的含量減少［17］。我們推測興奮性氨基酸釋放的增多、抑制性氨基酸釋放的減少可能是水楊酸鈉對神經元上各種電壓門控性離子通道的綜合作用的結果。這是因為它對電壓門控性鉀通道和鈉通道的抑制會導致神經遞質釋放的增多，而它對電壓門控性鈣通道的抑制會導致神經遞質釋放的減少。本試驗結果只顯示了海馬神經元上某種離子通道的總體的變化情況，并未對神經元進行詳細劃分（例如分為興奮性和抑制性神經元兩大類），所以若想弄清水楊酸鈉對神經遞質影響不同的確切原因，還有待于進一步研究。

本部分實驗利用腦片膜片鉗技術研究了水楊酸鈉對海馬部位神經元上的VGCC的影響。水楊酸鈉抑制ICa的幅度，且這種抑制作用具有濃度依賴性，使穩態激活曲線向超級化方向移動，導致海馬神經元的神經遞質減少。研究結果顯示，水楊酸鈉對海馬神經元上的VGCC有明顯影響，這可能與耳鳴不良情緒的產生相關。

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