丙戊酸通過CREB上調腦紅蛋白并保護N2a細胞免受雙氧水誘導的神經損傷

劉 寧，尋 禹，李亞丹，王婷婷，鐘愛軍，姚亮元，袁秀菊，向雙林

（1.湖南千金湘江藥業，湖南 株洲 412000；2.湖南師范大學生命科學學院，湖南長沙 410000；3.湖南省生物發育工程與新產品研發協同創新中心，湖南長沙 410000）

中風和神經退行性疾病能夠引發內源的神經保護機制，而對內源的神經保護機制加以利用可能引導新的治療這兩種疾病的方向［1］。腦紅蛋白（neuroglobin，Ngb）是神經系統特異表達的氧結合球蛋白［2］，能夠保護大腦神經元免受缺血缺氧、氧化應激以及淀粉粥樣蛋白（amyloid beta，Aβ）誘發的神經損傷［3－4］。因此，上調大腦中內源性腦紅蛋白的藥物具有預防和治療多種神經系統疾病的潛力。丙戊酸（valproic acid，VPA）及丙戊酸鹽在臨床上被廣泛用于作為治療癲癇、躁郁等的精神類藥物［5］。另外，丙戊酸還具有作為神經保護類藥物預防和治療神經系統疾病的潛力［6－7］。但是，丙戊酸的神經保護作用和機制還不是很清楚。本研究表明，丙戊酸通過轉錄因子CREB在轉錄水平上上調腦紅蛋白的表達，并保護雙氧水誘導的神經損傷，這為丙戊酸作為神經保護藥物進一步提供了依據。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑 丙戊酸、100×蛋白酶抑制劑、雙氧水、Ngb單抗和β-actin單抗購買自Sigma公司；DMEM培養基、胰酶、L谷氨酰胺、First Strand Superscript IIkit、Lipofectamine 2000TM轉染試劑購買自Invitrogen公司；胎牛血清購買于Gibco公司；神經細胞株Neuro2A（N2a）、SKNSH細胞購買自ATCC公司；PCMV-HA、PCMV-CERB以及CREB突變載體購買自Clone-tech公司；pGL3-Basic載體購買于Promega公司；化學發光ECL試劑盒購買自GE公司；RNeasy plusminikit購買自Qiagen；熒光素酶報告基因試劑盒購買自Promega公司；SYBR Green試劑盒購買自Life Technologies公司；小鼠和人腦紅蛋白和18s rRNA RT引物購買自SABioscience公司。

1.2 報告基因載體的構建 小鼠腦紅蛋白啟動子載體 pGL3-mNgbp（P-2033）于以前構建［8］。人腦紅蛋白啟動子區域由 PCR用如下引物擴增：5′-CCCTCGAGGCTTAGGCCCATCCAGATTC-3′（前導引物）和 5′-CCCTCGAGCTGGCGCGGGAGAGAAAAG-3′（反向引物）。擴增產物克隆進入載體pGL3-Basic，并命名為pGL3-hNgbp。序列送上海生物工程公司測序確定正確性。

1.3 細胞培養、轉染 小鼠和人神經母細胞瘤細胞系N2a和SKNSH細胞培養于包含10%FBS的DMEM培養液的培養皿，然后將培養皿放置于37℃、5%CO2、90%相對濕度培養箱中。待細胞密度至70%的時候，將細胞培養液換成無血清培養基，根據Lipofectamine 2000TM轉染試劑的說明書轉染pCMV-HA或者pCMV-CERB以及突變載體或報告基因載體進入細胞中。

1.4 藥物處理 用100%DMSO將丙戊酸稀釋成儲存液（300 mmol·L－1）或將 KG-501配制成儲存液（20 mmol·L－1），用水將雙氧水稀釋成儲存液（50 mmol·L－1）。轉染24 h之后，用丙戊酸或 KG-501或雙氧水（均1∶1 000稀釋于培養基中）按實驗要求處理細胞24 h。每個濃度設3個平行孔，重復至少3次。空白對照組含有與丙戊酸同濃度的DMSO（300μmol·L－1）。

1．5 W estern印跡法 處理過后的N2a和SKNSH細胞經包含100×蛋白酶抑制劑細胞裂解液裂解后，16 000×g，4℃離心5 min后取上清，用 Bradford法定量。取30μg的蛋白與上樣緩沖液混合并100℃條件下變性10 min。點樣、跑膠并轉膜，然后進行Western blot實驗，具體為：先將膜用包含Ngb單抗或β-actin單抗的脫脂牛奶在4℃條件下孵育過夜后，用TTBS洗3次，每次15 min。然后再用包含相應的二抗的脫脂牛奶室溫孵育1 h，再用TTBS洗3次，每次15 min。然后用化學發光法顯影。

1．6 RT-PCR 通過 RNeasy plusmini kit提取總RNA，然后取1μg的總 RNA用 First Strand Superscript II kit進行反轉錄。通過ABI7500檢測系統（Applied Biosystems）結合 SYBR Green kit檢測腦紅蛋白mRNA。

Fig 1 Effect of VPA on Ngb protein levels in N2a cells（A）and SKNSH cells（B）and mRNA levels in N2a cells（C）and SKNSH cells（D）（n＝3）*P＜0.05，**P＜0.01 vs control.

1.7 熒光素酶活性分析 接種細胞于24孔板，待細胞長至80%，將相應的報告基因載體連同內參海腎熒光報告基因質粒PRL-TK用脂質體Lipofectamine 2000TM轉染試劑轉入細胞中。收獲細胞時，吸去培養液，PBS漂洗細胞，吸凈PBS。然后按照熒光素酶報告基因試劑盒的說明進行操作。

1．8 M TT檢測 將24孔板中細胞用MTT以1 g·L－1的終濃度處理，并孵育于37℃約2 h。然后小心吸取上清，加100μl的DMSO進入96孔板中溶解紫色沉淀，并在室溫下于搖床上搖10 min。待紫色沉淀完全溶解后，將96孔板于讀板儀測定570 nmol·L－1和630 nmol·L－1的吸光度值 （OD570值和OD630值）。MTT值 ＝OD570值 －OD630值。

1.9 統計學分析 所有數據采用ˉx±s表示，兩組之間比較采用 student′s t test，多組之間比較采用One-way ANOVA和Tukey-Kramer檢驗。

2 結果

2．1 丙戊酸上調小鼠和人腦紅蛋白的蛋白和mRNA表達水平 Western blot結果表明，丙戊酸能夠分別劑量依賴（0、100、300μmol·L－1）地上調小鼠和人腦紅蛋白的表達（Fig 1A和Fig 1B）。另外，實時定量PCR實驗表明，丙戊酸能夠分別劑量依賴（0、100、300μmol·L－1）地上調 N2a和 SKNSH細胞中腦紅蛋白的mRNA水平（Fig 1C和Fig 1D）。

2.2 丙戊酸誘導上調小鼠和人腦紅蛋白基因的轉錄活性 熒光素酶活性實驗發現，丙戊酸不但能夠劑量依賴（0、100、300μmol·L－1）地明顯上調小鼠N2a細胞中腦紅蛋白的啟動子活性（Fig 2A），還能夠劑量依賴（0、100、300μmol·L－1）地明顯上調人SKNSH細胞中腦紅蛋白的啟動子活性（Fig 2B）。

Fig 2 Effect of VPA on the mouse Ngb promoter activity in N2a cells（A）and the human Ngb promoter activity in SKNSH cells（B）（n＝4）*P＜0.05，**P＜0.01 vs control.

2．3 轉錄因子CREB介導了丙戊酸誘導的腦紅蛋白的表達上調 丙戊酸（300μmol·L－1）明顯上調了腦紅蛋白啟動子活性，然而，CREB特異的抑制劑KG-501（20μmol·L－1）明顯削弱了丙戊酸誘導的腦紅蛋白啟動子活性上調 （Fig 3A）。而過表達野生型CREB（pCMV-CREB）能夠進一步明顯促進丙戊酸（300μmol·L－1）誘導的腦紅蛋白啟動子活性的上調，但是過表達突變型CREB（pCMV-KCREB）極大地抑制了丙戊酸（300μmol·L－1）誘導的腦紅蛋白啟動子活性的上調（Fig 3B）。

Fig 3 Effect of KG-501（A）and CREB mutant（B）on VPA-induced mouse Ngb promoter activity in N2a cells（n＝4）*P＜0.05 vs control（DMSO treatment）；＃P＜0.05 vs VPA treatment.

2．4 丙戊酸保護小鼠N2a細胞免受雙氧水刺激誘發的損傷 丙戊酸可能通過上調腦紅蛋白的表達保護神經細胞免受氧化應激誘導的神經損傷。盡管丙戊酸與DMSO處理相比，N2a細胞的細胞活力沒有變化。通過雙氧水（50μmol·L－1）處理能夠明顯減少小鼠N2a細胞的活力。然而，用丙戊酸（300 μmol·L－1）預處理24 h，然后再用雙氧水（50μmol·L－1）處理24h后發現，丙戊酸能夠明顯抑制雙氧水導致的細胞活力降低（Fig 4）。

Fig 4 Role of VPA in against H2 O2-induced neurotoxicity（n＝3）*P＜0.05 vs control（DMSO treatment）；＃P＜0.05 vs H2 O2 treatment.

3 討論

腦紅蛋白能夠保護神經元免受缺血缺氧性中風等神經系統疾病誘發的神經損傷［3－4］，但是腦紅蛋白是內源性的蛋白，需要通過外源性的藥物刺激其表達。丙戊酸能夠同時上調小鼠和人腦紅蛋白的蛋白水平和啟動子活性，提示丙戊酸可能通過上調腦紅蛋白的表達發揮神經保護作用。然而，丙戊酸是怎樣上調腦紅蛋白的呢？以前的研究表明，丙戊酸能夠刺激CREB蛋白氨基酸序列133位點絲氨酸的磷酸化，從而促進轉錄因子CREB的轉錄活性［10］，而CREB能夠上調小鼠腦紅蛋白的表達［11］。本研究發現，特異的CREB抑制劑KG-501和CREB突變體KCREB能夠抑制丙戊酸誘導的腦紅蛋白的表達上調，證實CREB參與了丙戊酸誘導的腦紅蛋白的表達，為今后進一步研究丙戊酸的神經保護機制提供了理論依據。

值得注意的是，1.0 mmol·L－1丙戊酸能夠抑制人膠質母細胞瘤細胞增殖，而≥2.0 mmol·L－1丙戊酸則能夠明顯誘導其凋亡，說明高濃度丙戊酸具有干預和治療人膠質母細胞瘤的潛力［12］，而本研究證明300μmol·L－1丙戊酸能夠保護N2a細胞免受氧化應激誘導的神經損傷。因此，低劑量的丙戊酸具有開發成神經保護藥物的潛力。雖然，我們的研究并不具有直接論證丙戊酸誘導的腦紅蛋白的表達水平與其神經保護能力的相關性，但是丙戊酸發揮神經保護作用可能部分依賴于腦紅蛋白的表達上調。本研究檢測了丙戊酸對腦紅蛋白的影響，探尋了丙戊酸上調腦紅蛋白的機制，并分析了丙戊酸抗雙氧水誘導的神經損傷的能力，為丙戊酸干預和治療神經系統疾病提供了理論支持。

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