自噬在As2O3誘導Burkitt淋巴瘤Raji細胞死亡中的作用及機制研究

李彩麗，陳 靜，王 蓓，王菲菲，田寶瑩，謝 蓓，范臨蘭，魏虎來

(1.蘭州大學基礎醫學院，甘肅省新藥臨床前研究重點實驗室，甘肅蘭州 730000，2.西北民族大學醫學院生物化學與分子生物學教研室，甘肅蘭州 730030)

自噬(autophagy)是細胞在缺氧、營養缺乏、藥物等代謝壓力下，通過降解其自身細胞內的大分子物質、細胞器和胞質的“自我消化”過程:粗面內質網的無核糖體附著區脫落的雙層膜包裹部分需降解的細胞器、蛋白質等成分形成自噬體(autophagosome)，再與溶酶體融合形成自噬溶酶體(autolysosome)，降解其所包裹的內容物，達到清除受損物和能量再利用的目的［1－2］。三氧化二砷(Arsenic trioxide，As2O3)已在臨床上成功用于急性早幼粒細胞白血病(acute promyelocytic leukemia，APL)的治療［3］。同時，As2O3對其它血液腫瘤、淋巴瘤及實體瘤也有較好的療效［4－6］。我們的前期研究證實，As2O3可有效誘導白血病和腫瘤細胞凋亡［7－9］。As2O3能否誘導惡性淋巴瘤細胞發生自噬以及細胞自噬在As2O3殺傷惡性淋巴瘤細胞中的作用尚不清楚。本文以Burkitt淋巴瘤Raji細胞為研究對象，研究自噬活性在As2O3誘導Raji細胞死亡中的作用。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 As2O3(美國Sigma公司)用0.1 mol·L－1NaOH溶解，調整溶液pH值，PBS配制成10 mmol·L－1的貯存液;自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)和自噬誘導劑雷帕霉素(rapamycin，Rapa)均購自美國Sigma公司，3-MA用PBS配制成100 mmol·L－1貯存液，分裝避光冰凍保存;Rapa用DMSO配成2 mmol·L－1貯存液。單丹黃酰尸胺(monodansyl cadaverine，MDC)、MTT均購自美國Sigma公司;AnnexinⅤ/PI細胞凋亡檢測試劑盒(上海蔚宏生物科技有限公司);TRIzol購自 Invitrogen公司，β-actin、Bcl-2和 p53引物由TaKaRa公司設計合成;細胞裂解液 RIPA試劑盒、蛋白定量BCA試劑盒均購自上海碧云天生物技術有限公司;PVDF膜(美國Millipore公司);微管相關蛋白1輕鏈-3(LC-3)抗體、β-actin抗體購自美國Cell Signaling Technology公司;Raji細胞購自中國科學院上海生化細胞研究所。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養與實驗分組 Raji細胞以5×107·L－1接種于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養液的培養瓶中，37℃、5%CO2、飽和濕度下培養，取對數生長期細胞進行實驗。實驗分為4組:對照組、As2O3作用組、3-MA聯合 As2O3組和 Rapa聯合As2O3組，其中3-MA 聯合As2O3組用4 mmol·L－13-MA預先處理細胞3 h后再加入As2O3。

1.2.2 細胞增殖活性檢測 調整細胞濃度為5×107·L－1，接種于96孔培養板中，每組6個復孔，根據實驗設計培養不同時間后，每孔加入MTT(5 g·L－1)10 μl，再繼續培養 4 h，每孔加 10%SDS 過夜，全自動酶聯免疫檢測儀(Bio-Tek X，Bio-Tek公司，美國)檢測570 nm波長下的吸光度A值，根據如下公式計算細胞生長抑制率:

1.2.3 Annexin-V/PI雙標記染色檢測凋亡 根據MTT結果，選用3 μmol·L－1As2O3單獨及聯合 3-MA或Rapa作用48h，離心收集細胞，PBS洗滌，結合緩沖液重懸細胞，加入Annexin V-FITC和PI(propidium iodide)，室溫避光孵育，流式細胞儀(Coulter Epics XL，Beckman-Coulter，美國)檢測細胞凋亡。實驗重復3次。

1.2.4 細胞周期測定 收集細胞，PBS洗滌2次，用70%乙醇4℃固定過夜，再用PBS洗滌細胞2次，加PI和RNase，避光室溫放置30 min，FCM檢測細胞周期。實驗重復3次。

1.2.5 電鏡觀察細胞超微結構 離心收集細胞，PBS洗滌，3%戊二醛固定，1%四氧化鋨固定，梯度丙酮脫水，Epon812包埋，超薄切片，醋酸鈾及枸櫞酸鉛雙重染色，透射電鏡(JEM-1230，日本電子公司)觀察細胞凋亡及自噬的超微結構。

1.2.6 MDC熒光染色觀察自噬體 MDC能選擇性地結合到自噬囊泡膜上而被用來檢測自噬的發生［10］。收集細胞加入 0.05 mmol·L－1MDC 于37℃避光孵育1 h，PBS洗，離心涂片機離心涂片后熒光顯微鏡(AX80，OLYMPUS，日本)下觀察［7］。

1.2.7 Western blot檢測 LC-3Ⅰ/Ⅱ蛋白水平 收集細胞用RIPA試劑裂解，細胞裂解上清液經SDSPAGE電泳分離，轉至 PVDF膜上，5% 脫脂奶粉封閉后加入LC-3和β-actin抗體共同孵育1.5 h，加入IRDye700DX和IRDye800CW標記二抗室溫孵育，紅外熒光成像系統(Odyssey，LI-COR，美國)分析條帶熒光強度。

1.2.8 定量RT-PCR檢測bcl-2和p53 mRNA的表達水平 收集5×105細胞，TRIzol法裂解提取細胞總RNA，依據SuperScriptⅡ RT First-Strand試劑盒說明逆轉錄合成cDNA，實時熒光定量PCR儀(Rotor-Gene 3000，Corbett，澳大利亞)進行定量擴增。基因表達定量通過分析軟件Rotor-Gene 6.0采用比較閾值法進行分析。目的基因的相對表達量F=2－ΔΔCt，ΔΔCt=(Ct管家基因－ Ct目的基因)對照－ (Ct管家基因－Ct目的基因)實驗組。收集PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳。實驗重復3次。

2 結果

2.1 As2O3誘導的Raji細胞自噬活化 Raji細胞經3 μmol·L－1As2O3作用48 h，電鏡觀察呈典型的凋亡形態學改變，同時在胞質內可見大量自噬體形成(如Fig 1箭頭所示);MDC熒光染色在細胞核周區域可出現大量點塊狀熒光，胞內熒光強度比對照細胞明顯增強;LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ轉化是細胞自噬的特異性標志，蛋白印跡法檢測顯示LC3-Ⅱ蛋白的量明顯增高(Fig 2)。提示As2O3可誘導Raji細胞發生自噬活化。同時，自噬抑制劑3-MA明顯抑制As2O3誘導的自噬活性，而自噬誘導劑Rapa則可進一步提高As2O3誘導的細胞自噬水平(Fig 1、2)。

2.2 As2O3單獨及聯合3-MA或Rapa對Raji細胞增殖活性的影響 As2O3對Raji細胞的增殖有明顯的抑制作用，呈時間、濃度依賴性(P＜0.05)，24、48和72 h的IC50值分別是(3.51±0.13)、(1.57±0.32)、(1.03 ±0.08)μmol·L－1(Fig 3)。3-MA 預處理抑制Raji細胞自噬，可明顯降低Raji細胞對As2O3的敏感性，IC50值分別增加了38.2%、41.4%和60.2%;而Rapa誘發Raji細胞自噬則增高Raji細胞對 As2O3的敏感性，其 IC50值分別降低了30.5%、12.1% 和9.7%(Fig 4)。在我們的預實驗中，4 mmol·L－13-MA 和 2 μmol·L－1Rapa 單獨作用，其對 Raji細胞增殖活性的最高抑制率小于12%，說明本文中所用濃度的3-MA和Rapa對Raji細胞僅有極輕微的毒性效應。

2.3 As2O3單獨及聯合3-MA或Rapa對Raji細胞凋亡與周期的影響 如Fig 5所示，3 μmol·L－1As2O3作用48 h，Raji細胞G0/G1期細胞減少、G2/M期細胞增高2.2倍，細胞總凋亡率為39.9%，提示As2O3可將細胞阻滯在G2/M期和誘導Raji細胞發生凋亡。采用3-MA抑制細胞自噬活性，As2O3誘導的細胞總凋亡率降低約50%，G0/G1期細胞增加、G2/M期細胞降至對照細胞水平，說明3-MA抑制自噬活性可逆轉As2O3誘導的細胞凋亡和G2/M期阻滯，降低Raji細胞對As2O3的敏感性。與此相反，采用Rapa促進細胞自噬活性，As2O3誘導的細胞凋亡率增高約50%;G0/G1期細胞降低1.6倍而G2/M期細胞則增加1.8倍。提示Rapa誘導自噬可促進As2O3誘導的細胞凋亡和細胞周期阻滯，提高Raji細胞對As2O3的敏感性。

Fig 1 Effect of 3-MA or Rapa on autophagic activity of Raji cells induced by As2O3

Fig 2 Effect of 3-MA or Rapa on conversion of LC3-I to LC3-IIin Raji cells induced by As2O3

2.4 As2O3單獨及聯合3-MA或Rapa對Raji細胞bcl-2 mRNA表達的影響 抗凋亡基因bcl-2既可抑制凋亡，又可與自噬相關蛋白結合而抑制細胞自噬［11］。RT-PCR 檢測發現，3 μmol·L－1As2O3明顯下調Raji細胞bcl-2 mRNA的表達(P＜0.01)。3-MA預處理可逆轉As2O3誘導的bcl-2 mRNA的表達降低，而Rapa則進一步降低As2O3下調的bcl-2 mRNA表達水平(Fig 6)。研究結果提示As2O3誘導Raji細胞凋亡與其抑制bcl-2基因表達有關，3-MA和Rapa可通過調控bcl-2基因和細胞自噬，調節As2O3誘導的Raji細胞死亡。

Fig 3 Anti-proliferative effects of As2O3on Raji cells

Fig 4 Sensitivity of Raji cells to As2O3after regulation of autophagy activity by 3-MA or Rapa

Fig 5 Effect on As2O3-induced apoptosis and cell-cycle arrest in Raji cells after regulation of autophagy activity by 3-MA or Rapa

Fig 6 Expression of bcl-2 mRNA in Raji cells induced by As2O3alone or in combination with 3-MA or Rapa

2.5 As2O3聯合3-MA 或 Rapa對 Raji細胞 p53 mRNA表達的影響 細胞毒藥物可激活p53基因而抑制mTOR，促進自噬小體形成和LC3脂化而誘發細胞自噬［12］。3 μmol·L－1As2O3可明顯增強Raji細胞p53 mRNA的表達(P＜0.01)。3-MA可降低Raji細胞被As2O3增強的p53 mRNA的表達水平;相反，Rapa可加強As2O3對p53 mRNA表達的上調作用(Fig 7)。上述結果提示3-MA可能通過降低p53基因表達而抑制細胞自噬活性進而抑制As2O3誘導的細胞凋亡，而Rapa則通過促進p53表達、激活自噬而增強As2O3誘導的細胞凋亡。

Fig 7 Expression of p53 mRNA in Raji cells induced by As2O3alone or in combination with 3-MA or Rapa

3 討論

越來越多的研究證據表明，化療藥物在誘導腫瘤細胞發生凋亡的同時，可導致細胞自噬活性增強［13］。目前有關自噬在腫瘤藥物治療中的作用及機制的研究結論尚存在矛盾。Sun等［14］用表柔比星誘導乳腺癌細胞時發現激活自噬可促進腫瘤細胞的耐藥性，而抑制自噬則增加腫瘤細胞對化療藥物的敏感性;而Goussetis等［15］的研究證實自噬可通過促進腫瘤細胞凋亡、壞死等機制或直接誘導細胞發生自噬性死亡而抑制腫瘤細胞生長。因此，自噬的作用可能與腫瘤組織細胞類型和誘導發生自噬的藥物種類有關。

As2O3對白血病和實體腫瘤有較好的療效［4，6］，有研究表明As2O3可抑制淋巴瘤細胞的增殖，主要作用機制為誘導細胞凋亡［16］。有關自噬活性在As2O3誘導淋巴瘤細胞死亡中的作用尚未見報道。我們的研究證實As2O3在誘導Burkitt淋巴瘤Raji細胞凋亡的同時可激活細胞自噬，采用自噬抑制劑3-MA和自噬誘導劑Rapa分別抑制或增強細胞的自噬活性，則可明顯降低或提高Raji細胞對As2O3的敏感性。上述研究結果強烈提示自噬在As2O3誘導Raji細胞死亡機制中發揮著關鍵作用。

Bcl-2主要通過與Beclin-1之間的相互作用抑制細胞自噬，而p53參與細胞自噬的調控，細胞毒藥物激活p53可抑制mTOR通路進而促進細胞自噬。同時，Bcl-2家族成員Bax、Bad和 Puma等可被 p53反式激活，解除Bcl-2/Bcl-xL和Beclin-1之間的抑制作用或磷酸化Beclin-1而增強細胞自噬［17］。因此，Bcl-2和p53不僅調控細胞凋亡，而且參與細胞自噬活性的調節。我們的研究證實，As2O3誘導Raji細胞凋亡過程中明顯抑制bcl-2基因和增強p53基因的表達。自噬抑制劑3-MA則可上調bcl-2基因表達和下調p53基因表達以及抑制細胞自噬活性，降低As2O3誘導的細胞死亡;而自噬誘導劑Rapa的作用則與3-MA的效應正好相反。提示在As2O3誘導的Raji細胞凋亡和自噬中bcl-2基因和p53基因起著重要的調控作用，調節著Raji細胞對As2O3的敏感性。

綜合上述，細胞凋亡和自噬性細胞死亡共存于As2O3誘導的Raji淋巴瘤細胞死亡中，Bcl-2和p53可能起著關鍵的調控作用。調控細胞的自噬水平可改變腫瘤細胞對As2O3敏感性的事實，有助于在臨床特定腫瘤的治療中輔助應用特異性自噬抑制劑或誘導劑，探尋腫瘤治療的新途徑。

［1］顏次慧，梁中琴，顧振綸，秦正紅.自噬在細胞生存和腫瘤發生中的作用［J］.中國藥理學通報，2005，21(3):269－73.

［1］Yan C H，Liang Z Q，Gu Z L，Qin Z H.The role of autophagy in cell survival and tumor development［J］.Chin Pharmacol Bull，2005，21(3):269 －73.

［2］Levine B，Kroemer G.Autophagy in the pathogenesis of disease［J］.Cell，2008，132:27 －42.

［3］Chen G Q，Shi X G，Tang W，et al.Use of arsenic trioxide(As2O3)in the treatment of acute promyelocytic leukemia(APL).I.As2O3exerts dose-dependent dual effects on APL cells［J］.Blood，1997，89:3345 －53.

［4］Li Y M，Broome J D.Arsenic targets tubulins to induce apoptosis in myeloid leukemia cells［J］.Cancer Res，1999，59:776 －80.

［5］Akao Y，Mizoguchi H，Kojima S，et al.Arsenic induces apoptosis in B-cell leukaemic cell linesin vitro:activation of caspases and down-regulation of Bcl-2 protein［J］.Br J Haematol，1998，102:1055－60.

［6］郭 紅，于 洪，王天祿.三氧化二砷對人肺腺癌A549細胞的放射增敏作用［J］.中國腫瘤，2012，21(10):784－6.

［6］Guo H，Yu H，Wang T L.The radiosensitizing effect of As2O3on lung adenocarcinoma cell line A549 ［J］.China Cancer，2012，21(10):784－6.

［7］Cheng J，Wei H L，Chen J，Xie B.Antitumor effect of arsenic trioxide in human K562 and K562/ADM cells by autophagy［J］.Toxicol Mech Methods，2012，22(7):512 －9.

［8］Cheng J，Chen J，Xie B，Wei H L.Acquired multidrug resistance in human K562/ADM cells is associated with enhanced autophagy［J］.Toxicol Mech Methods，2013，23(9):678 －83.

［9］Chen J，Wei H L，Xie B，et al.Endoplasmic reticulum stress contributes to arsenic trioxide-induced apoptosis in drug-sensitive and-resistant leukemia cells［J］.Leukemia Res，2012，36(12):1526－35.

［10］Biederbick A，Kern H F，Elsasser H P.Monodansylcadaverine(MDC)is a specificin vivomarker for autophagic vacuoles［J］.Eur J Cell Biol，1995，66:3 －14.

［11］Pattingre S，Tassa A，Qu X，et al.Bcl-2 anti-apoptotic proteins inhibit Beclin-1 dependent autophagy［J］.Cell，2005，122:927－39.

［12］Tasdemir E，Chiara Maiuri M，Morselli E，et al.A dual role of p53 in the control of autophagy［J］.Autophagy，2008，4(6):810 －4.

［13］Debnath J，Baehrecke E H，Kroemer G.Does autophagy contribute to cell death［J］?Autophagy，2005;1:66 －74.

［14］Sun W L，Chen J，Wang A P，Zheng H.Autophagy protects breast cancer cells from epirubicin-induced apoptosis and facilitates epirubicin-resistance development［J］.Autophagy，2011，9:1035－44.

［15］Goussetis D J，Altman J K，Glaser H，et al.Autophagy is a critical mechanism for the induction of the anti-leukemic effects of arsenic trioxide［J］.J Biol Chem，2010，285(39):29989 －97.

［16］龍 軼，李惠民，卿 晨，等.三氧化二砷誘導淋巴瘤Raji細胞凋亡與細胞周期阻滯［J］.中國實驗血液學雜志，2008，16(6):1320－4.

［16］Long Y，Li H M，Qing C，et al.Apoptosis and cell cycle arrest in lymphoma Raji cells induced by arsenic trioxide［J］.J Exp Hematol，2008，16(6):1320 －4.

［17］Krejci O，Wunderlich M，Geiger H，et al.P53 signaling in response to increased DNA damage sensitizes AML1-ETO cells to stress-induced death［J］.Blood，2008，111(4):2190 － 9.