大胡蜂肥大細胞脫粒肽對血管生成的抑制作用

劉文君，徐學清

（南方醫科大學藥學院，廣東，廣州 510515）

在過去的幾十年里，蜂毒因為含有許多藥理活性物質而引起了人們的密切關注，這些對于大胡蜂防御天敵和捕食等生存活動所必須的藥理活性分子包括：多肽類，如，趨化肽、肥大細胞脫粒肽［1－2］；酶類，如，磷脂酶 A2、透明質酸酶、酸（堿）磷酸酶［3］；有機小分子，如，組胺、膽堿、甘油、氨基酸等。眾多活性分子使蜂毒具有抗炎、鎮痛、抗病毒和抗腫瘤等多種藥理活性，在臨床上可被應用于治療腫瘤、風濕和肩周炎等多種疾病。

血管生長與抗腫瘤有密切聯系，很多具有血管生長抑制活性的物質同時具有抗腫瘤活性。宋長城等［4］報道蜂毒有抑制血管生成作用，且推斷蜂毒抑制肝癌血管生成可能是其抗腫瘤作用的重要機制之一。

在過去的研究中，我們從大胡蜂毒中分離純化得到一組肥大細胞脫粒肽［2］，盡管肥大細胞脫粒肽有數種生物活性，如磷脂酶A2、磷脂酶C、G蛋白和鳥苷酸環化酶活化，細胞脫顆粒和抗菌等活性［2，5－6］，但是發現其具有血管生長抑制活性尚屬于首次，現將結果報道如下：

1 材料與方法

1.1 材料 實驗用受精雞胚（10 d齡）購自華南農業大學；Wistar大鼠：南方醫科大學實驗動物中心；大胡蜂肥大細胞脫粒肽12a（INWKGIAAMAKKLL）：本實驗室合成；扶濟復（重組人堿性成纖維細胞生長因子，rh-bFGF），北京雙鷺藥業股份有限公司，批號：20041212；0.1% 新潔爾滅：上海經緯化工有限公司；定性濾紙：英國Whatman公司產品，批號：002090；帶數碼相機顯微鏡：德國 Leica公司；RPMI 1640培養基、胰酶、小牛血清均來自Gibco公司；BD BioCoatTM血管生長板購自 BD Biosciences；MTT檢測試劑盒來自建成生物工程研究所；其他試劑：國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 雞胚絨毛尿囊膜（CAM）實驗

1.2.1.1 供試品載體的制備 將過濾除菌的12a和rh-bFGF溶液分別或一起均勻涂布于直徑為5 mm的無菌Whatman濾紙上，使實驗組紙片除含有rh-bFGF 0.2μg外，還分別含有0.1或1μg的12a，陽性對照組上含有rh-bFGF 0.2μg，陰性對照含有蒸餾水，所有紙片均自然風干。

1.2.1.2 藥物處理 10日齡雞胚隨機分組，每組10只，在照卵燈下觀測，然后在距胚頭前1 cm、兩條卵黃靜脈之間的卵殼投影部位，用鉛筆畫出相對無血管區。用0.1%新潔爾滅擦拭雞胚蛋殼，在雞胚氣室處鉆一小孔，負壓吸引，使窗口處形成人工氣室。在已標記無血管處的蛋殼表面鉆孔，輕輕去除蛋殼及殼膜，暴露CAM。用鑷子夾取待試藥物濾紙片放在CAM上（加藥面向下），醫用膠布密封窗口，放入孵育箱37℃繼續孵化2 d，揭開封口膠布，按照朱國福等［7］的方法對CAM進行處理和結果判斷。10個經12a紙片處理的CAM血管生成抑制率＝［（＋）＋（＋＋）］／10。

1.2.2 人臍靜脈內皮細胞（HUVEC）增殖和血管形成實驗 根據MatrigelTM基質用戶手冊準備BD Bio-CoatTM血管生長板。在96孔板上，HUVEC用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養基培養到70%～80%滿，胰酶消化后，50μl 4×108細胞·L－1細胞懸液接種到包被了Matrigel基質的培養板上，在含5%CO2的培養箱內37℃培養16～18 h。用MTT法測量12a對HUVEC生長的抑制情況，血管生成實驗板用帶數碼相機的顯微鏡觀察并拍照。用MetaMorph軟件系統測量血管點面積，長度和分枝點計算血管形成［8］。結果統計時，沒有12a而只有PBS和rh-bFGF的孔看做100%，所有實驗濃度至少做4個重復。

1.2.3 統計學分析 采用Excel軟件分析，數據用表示，組間比較用t檢驗。

2 結果

2．1 大胡蜂肥大細胞脫粒肽12a抑制CAM生成

結果如Fig 1所示，蒸餾水組CAM血管生長良好，顏色鮮紅，血管分支適中，網絡清晰，呈葉脈樣放射狀生長；rh-bFGF對照組血管生長更旺盛，密度明顯增大，管徑粗且分支多；12a處理組則大范圍血管明顯褪色，血管密度減少，結構模糊，分支多處斷開。并且隨濃度加大，毛細血管數目較對照組明顯減少，顏色更淺、更蒼白，載體放置的中間部位和周邊幾乎都無血管生成。對各組的統計分析表明：0.1μg和1μg 12a對CAM生成的抑制率分別為60.2%和90.3%。顯然，大胡蜂肥大細胞脫粒肽12a能明顯抑制新生血管生成。

2．2 大胡蜂肥大細胞脫粒肽12a抑制HUVEC增殖和血管形成 在 Fig 2，1 mg·L－1和10 mg·L－1的12a能明顯抑制HUVEC的體外增殖（P＜0.01），其IC50接近1mg·L－1。和CAM血管生成抑制試驗以及HUVEC的體外增殖結果相一致，12a能明顯抑制HUVEC在96孔板上形成血管環，與對照組相比，在1 mg·L－1時內皮細胞簇集和血管形成明顯降低，在10 mg·L－1時內皮細胞血管環形成幾乎完全消失。因此，大胡蜂肥大細胞脫粒肽12a能明顯抑制血管生成。

3 討論

癌細胞的遷移和生長都依賴新生血管的生成［9］。因此，抗血管生成因子很有可能被研發成優良的抗腫瘤藥物。血管生成的體內實驗模型包括CAM法、卵黃囊膜法、鼠皮下氣囊法、微血管密度法、大鼠腸系膜窗血管生成法、動物角膜或虹膜內移植等。CAM血管生成模型因為實驗材料易得、操作簡便、實驗周期短等優點而成為國內外該類研究的最常用方法。但是CAM血管生成模型也存在一些缺陷，如，存在個體差異，加入載體后可能出現非特異性炎癥和結果很難精確測量等。我們在研究中對來自同一批，相同孵化條件下的多個雞胚進行重復試驗來減少實驗誤差。處理48 h后，對照組的CAM血管網絡清晰可見，生長良好。而12a處理組則大范圍血管明顯褪色，密度減少，結構模清晰，分支多處斷開。并且隨濃度加大抑制現象更明顯。這些數據表明12a對體內血管生成有較好的抑制作用。

Fig 1 Anti-angiogenic effects ofmastoparan-like peptide12a from wasp（Vespa magnifica）venom in CAM sFertilized chick embryoswere incubated under conditions of constant humidity at37℃.On the tenth day，a square window was open in the egg shell and CAMswere treated with（A）water，（B）0.2μg rh-bFGF，（C）0.1μg12a＋0.2μg rh-bFGF，（D，E）1μg12a＋0.2μg rh-bFGF.（F）Statistical analysis of the above treatment.CAMswere examined on day 12.**P＜0.01 vs0.2μg rh-bFGF

Fig 2 Effect of 12a on HUVEC proliferation and angiogenesis（A）Statistical analysis of proliferation and angiogenesis of HUVEC treated by 0，1，10 mg·L－1 12a；（B）Tube formation of HUVEC treated by 0，1，10 mg·L－1 12a，**P＜0.01 vs control

肥大細胞脫粒肽是蜂毒中重要組分，具有多種生物活性，其活化肥大細胞后導致肥大細胞釋放顆粒包含物組胺、5-羥色胺、白三烯、肝素、前列腺素、嗜酸性粒細胞趨化因子等［5－6］，肥大細胞及其顆粒包含物能加速CAM的正常血管生成［10－12］。因此，我們的試驗結果似乎與其相矛盾。但是肥大細胞在雞胚發育10.5 d后才在CAM上出現和在17.5～20 d后才達到豐盛［13］，并且15 d齡的雞胚的肥大細胞才對外界有免疫力，即能分泌顆粒物質［14］。因此，在我們的實驗系統中的CAM肥大細胞沒有活力，大胡蜂肥大細胞脫粒肽12a對CAM血管生長的抑制作用可能與其脫粒肽活性不相關聯。在我們過去的研究中12a僅有微弱的溶血活性［2］，因此，12a在目前的實驗濃度下抑制內皮細胞增殖不是由于其毒性作用所致。Ribatti等［11］認為CAM內主要的促進血管生長因子是纖維原細胞生長因子和血管內皮細胞因子。在實驗中，當我們在實驗組中不加入rh-bFGF，12a對CAM血管生長的抑制作用不是很明顯。并且12a對內皮細胞的增殖的抑制能力不如其對血管環的形成。因此，我們推測大胡蜂肥大細胞脫粒肽12a可能是通過作用于FGF相關的信號通路抑制內皮細胞增殖。另外，外源性能神經節苷脂GM1能結合FGF-2影響血管生成，但是mastoparan能抑制這種結合［15］。

因此，大胡蜂肥大細胞脫粒肽12a具有明顯的血管生成抑制活性，其作用機制尚不清楚，它能否與VEGF、FGF和內皮抑素等血管生成相關的生長因子發生作用有待進一步探討。但該發現對肥大細胞脫粒肽12a的開發應用有重要意義。因為以前的研究已經表明大胡蜂肥大細胞脫粒肽12a毒副作用小，安全性好，易于合成和能特異性結合G蛋白受體等，若能將其開發為抗血管生成藥物將有著廣闊的應用前景。

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