甘草酸對AGEs培養腎小球系膜細胞及ECM表達的影響

侯紹章，鄭芳芳，李 媛，高 嶺

（1.寧夏醫科大學病理學系，2.寧夏心腦血管疾病重點實驗室，3.寧夏醫科大學藥學院，4.寧夏醫科大學護理學院，寧夏銀川 750004）

糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）是常見的糖尿病慢性微血管并發癥，是終末期腎衰的主要原因之一。糖尿病患者長期的高血糖與體內一些半衰期較長的蛋白質通過非酶糖化反應生成糖化終產物（advanced glycation endproducts，AGEs），這是DN的一個重要發病機制。腎小球系膜細胞膜存在AGEs受體，AGEs與系膜細胞特異性受體結合后，能影響一系列細胞因子的釋放，并促進細胞外基質（extracellularmatrix，ECM）的產生，從而導致腎小球肥大、ECM積聚和腎小球硬化。生理條件下，ECM產生和降解的動態平衡處于機體的精確調控下。近年來的研究表明，由于糖代謝紊亂及其所導致的血流動力學、細胞因子、生長因子等多種因素綜合作用會使ECM生成增加而降解減少，這成為DN發生、發展的重要原因。FN是一類重要的高分子糖蛋白，在正常腎組織主要分布于腎小球系膜區，彼此以纖維狀結構相連，對維持腎小球正常結構起著重要的作用［1］。C-Ⅳ以膠原蛋白的非纖維形式存在，主要由上皮細胞、間質細胞、系膜細胞產生，它穿透整個腎小球形成膠原纖維網，并通過結合細胞黏附分子起到機械屏障作用，在ECM增殖中占主要成份［2］。

近年來，許多研究力求從草藥中尋找抗糖尿病藥，如紫檀櫚［3］、海參蟲草［4］和匙羹藤［5］等。甘草酸（glycyrrhizic acid，GA）是從甘草中提取的含量最高的皂苷類成分，研究表明，GA表現出諸如抗潰瘍、祛痰、抗病毒、抗炎、抗糖尿病、抗腫瘤、神經保護和增強免疫等多種藥理作用［6－8］。本實驗擬研究GA對AGEs培養的腎小球系膜細胞增殖、細胞周期及ECM的成分FN和C-Ⅳ的影響，為今后探討GA治療DN的作用及可能機制提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 藥品及試劑 GA（日本東京化成工業公司，TCI），大鼠腎小球系膜細胞株HBZY-1（北納創聯生物技術研究院），AGEs（Millipore公司，121800-10MG），大鼠纖維連接蛋白ELISA試劑盒（博士德生物），大鼠Ⅳ型膠原酶聯免疫試劑盒（CUSABIO），MTT試劑盒和細胞周期檢測試劑盒（南京凱基），細胞培養基DMEM、胰蛋白酶、胎牛血清（FBS）（Hyclone公司）。培養瓶、凍存管、96孔細胞培養板和吸管（Corning公司）。

1.1.2 實驗儀器 CO2培養箱（NO.NUAIR-NU-5510E，美國），超凈工作臺（BCM-1300A，蘇凈安泰），CF16-RX高速低溫離心機（日立公司），酶標儀（Bio-Tek），流式細胞儀（BD FACSCalibur），電子顯微鏡（BX61），蛋白成像系統（Bio-RAD）。

1.2 實驗方法

1.2.1 HBZY-1細胞培養及分組 傳代培養HBZY-1細胞，在含10%胎牛血清的低糖DMEM培養液中培養，當細胞生長達到80%融合時，用0.25%胰酶消化（37℃消化1 min）傳代，置于5%CO2培養箱內37℃孵育24 h。根據不同實驗所需細胞數，取不同細胞用胰酶消化制成細胞懸液。根據實驗需要，接種于96孔細胞培養板上或培養瓶里，繼續培養48 h使細胞生長達融合。細胞分組為：BSA對照組（200 mg·L－1的 BSA）、AGEs組（200 mg·L－1）、AGEs＋甘草酸組。

1.2.2 MTT細胞增殖檢測 取對數生長期的HBZY-1細胞，用胰酶消化后配成5×107·L－1懸液，接種到96孔培養板中，分為BSA對照組（200 mg·L－1）、AGEs組（200 mg·L－1）、AGEs＋甘草酸組，甘草酸濃度依次設為（12.5、25、50、100、200、400 μmol·L－1），每組設 5個復孔，各組設 3個生物學重復。每孔加入懸液100μl，24 h貼壁換液后，按實驗分組分別處理48 h，每孔加入50μl 1×MTT（5 g·L－1）孵育 4 h，鏡下觀察，MTT摻入細胞內，吸出上清，加入150μl DMSO使細胞內甲臜溶解，用平板搖床搖勻振蕩10 min，待細胞完全溶解后，放入自動酶標儀490 nm波長讀數，并記錄OD值，確定甘草酸的劑量。

1.2.3 細胞周期檢測 將接種密度為1×109·L－1的HBZY-1細胞分組后分別處理48 h，收集細胞，用PBS洗兩次，加70%的乙醇固定細胞，4℃過夜，次日離心（4℃，1 000 r·min－1，10 min）洗去乙醇，加入RNase 37℃孵育30 min，PI染色，室溫避光固定30 min。流式細胞儀對細胞進行周期測定。

1.2.4 ELISA法檢測細胞上清液FN和Ⅳ型膠原在細胞培養48 h末，收集每組細胞上清液，采用酶聯免疫法測定FN和Ⅳ型膠原，按試劑盒說明書進行操作。

1.2.5 統計學處理 計量資料以s表示，應用單因素方差分析進行組間比較。

2 結果

2．1 甘草酸對AGEs誘導HBZY-1細胞增殖的影響 分別以不同濃度的甘草酸（12.5、25、50、100、200、400μmol·L－1）作用于 AGEs誘導的 HBZY-1細胞48 h，MTT法檢測各組細胞的增殖。結果顯示：在GA為100μmol·L－1時對正常細胞無明顯影響，但對AGEs組細胞有抑制作用。作為我們后續實驗的濃度。與BSA對照組相比，AGEs組細胞增殖明顯增加（P＜0.05），與AGEs組相比，AGEs＋甘草酸組細胞增殖受到抑制且有統計學意義（P＜0.05）。見 Fig 1。

2．2 甘草酸對AGEs誘導HBZY-1細胞周期的影響 流式細胞儀分析顯示，與BSA對照組相比，AGEs組細胞S期延長，G1期縮短，且細胞增殖指數PI明顯升高（P＜0.05），表明AGEs可刺激HBZY-1的增殖。在藥物干預后，甘草酸有增加G1期細胞，降低S期細胞的作用，且PI降低，表明甘草酸可抑制HBZY-1在AGEs刺激下的過度增殖，起到保護HBZY-1的作用。見Fig 2和Tab 1。

Fig 1 Effect of GA on cell proliferation as determ ined by MTT assay*P＜0．05 vs BSA group；＃P＜0．05 vs AGEs group

Tab 1 Effect of GA on the cell cycling phase of HBZY-1 in AGEs medium detected w ith flow cytometric analysis

Tab 1 Effect of GA on the cell cycling phase of HBZY-1 in AGEs medium detected w ith flow cytometric analysis

*P＜0.05 vs BSA group；＃P＜0.05 vs AGEs group

Group G1S PI／%BSA 62.69±4.19 31.48±1.04 35.01±4.21 AGEs 53.81±1.51*38.84±1.94*44.93±0.25*AGEs＋GA 58.79±2.37＃ 34.89±1.13＃ 42.16±1.04＃

Tab 2 Effect of GA on HBZY-1 cell secretion FN and typeⅣcollagen induced by AGEs

2．3 細胞培養上清液中FN和Ⅳ型膠原含量的變化 實驗結果表明，正常情況下，體外培養的腎小球系膜細胞具有分泌ECM的功能，但在高糖情況下，系膜細胞分泌FN和Ⅳ型膠原明顯升高（P＜0.05）。說明高糖對HBZY-1細胞分泌FN和Ⅳ型膠原有促進作用。甘草酸組FN和Ⅳ型膠原含量有所減少（P＜0.05）。見Tab 2。

3 討論

腎小球系膜細胞在正常情況下由于有抑制腎小球系膜細胞增殖因子的存在，所以生長和分裂速率很慢［9］。但在病理條件下，生長與抑制失衡，增殖活躍，產生過多的系膜基質，導致系膜硬化，并最終形成腎小球硬化［10］。因此，抑制腎小球系膜細胞的過度增殖一直是防治腎臟纖維化的重要策略之一。

已有證據表明外源性的AGEs可造成實驗動物的DN［11］，用AGEs培養腎小球系膜細胞可導致其增殖及產生ECM增加［12］，這說明AGEs可獨立于高血糖作用于腎小球系膜細胞誘發DN。

ECM積聚是腎小球疾病發展至腎小球硬化的主要病理改變基礎［13］。腎小球的3種固有細胞（內皮細胞、上皮細胞和系膜細胞）均能產生ECM，其中尤以系膜細胞產生能力最強。ECM的大量積聚是腎小球硬化的重要因素，系膜細胞是腎小球內產生ECM的重要來源。正常生理情況下，ECM的合成與降解保持在一種動態平衡之中，但系膜細胞增殖后會打破平衡，導致ECM大量積聚。本實驗結果表明，甘草酸能抑制AGEs誘導的HBZY-1細胞的異常增殖，改變細胞周期，降低增殖指數，降低細胞FN和C-Ⅳ的分泌。這說明甘草酸能對抗AGEs對HBZY-1細胞的損傷作用，其可能是通過抑制AGEs誘導細胞的異常增殖來保護細胞免受AGEs的損害。另外，甘草酸能降低ECM中FN和C-Ⅳ的分泌。

Fig 2 Effect of GA on HBZY-1 cell cycle changes induced by AGEsA：BSA group；B：AGEs group；C：AGEs＋GA group

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