銀杏內酯B對內皮細胞連接蛋白的影響及其分子機制研究

劉雪青，陳北冬，鮑 利，吳 偉，孫文佳，齊若梅

（衛生部北京醫院／老年醫學研究所，衛生部老年醫學重點實驗室，北京 100730）

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是一種慢性血管炎癥性疾病［1］，其病理過程涉及血管內皮細胞損傷、血小板活化、白細胞浸潤等。內皮細胞受損在動脈粥樣硬化過程中是一個主要的病理特征。生理狀態下，內皮細胞通過細胞之間的緊密連接蛋白阻止循環中的有害成分向血管內膜下滲透。在動脈粥樣硬化血管炎癥的病理狀態下，循環中的細胞因子和趨化因子增多，損傷內皮細胞連接蛋白功能，導致血管滲透性增高，炎癥細胞向血管內膜下浸潤，促進動脈粥樣硬化的血管炎癥反應。

內皮細胞連接蛋白功能主要包括緊密連接（tight junction，TJ）、縫隙連接（gap junction，GAP）和黏著連接（adherens junction，AJ）。JAM-A（junctional adhesion molecule A）是參與構成緊密連接復合體的重要蛋白，可通過密閉小帶ZO（zonula occuden）與細胞骨架相連，具有調節血管滲透性、參與白細胞遷移等功能。臨床研究［2］表明動脈粥樣硬化患者血漿中JAM-A的水平明顯增高，TNFα促進內皮細胞JAM-A的表達，從而增強血小板與內皮細胞黏附。Cx43（connexin 43）是組成縫隙連接的基本單位，在相鄰細胞之間形成通道結構，允許可溶性小分子在相鄰細胞間通過，維持血管內皮的穩態。研究發現［3］，早期動脈粥樣硬化內膜增厚區Cx43明顯增多。本研究重點探討ox-LDL損傷內皮細胞JAM-A和Cx43的變化以及藥物干預的影響。

銀杏內酯B（ginkgolide B，GB）是血小板活化因子受體拮抗劑，我們先前的研究表明［4］，銀杏內酯B對ox-LDL刺激的內皮細胞損傷具有保護作用。然而，銀杏內酯B是否能夠改善內皮細胞連接蛋白的功能尚不清楚。本研究重點評價了銀杏內酯B對ox-LDL刺激的內皮細胞JAM-A、Cx43表達的影響以及分子機制，并通過白細胞遷移實驗分析銀杏內酯B對血管滲透性的影響，從而揭示銀杏內酯B減輕血管炎癥反應的新的藥理學作用。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 銀杏內酯B購自江蘇大觀園商貿公 司，純 度 為 95% （批 號：BAT2007115）。LY294002、膠原酶、明膠購自Sigma公司；胰蛋白酶、特級胎牛血清購自Hyclone公司，Medium 199培養基購自Gibco（Invitrogen公司）。Transwell小室購自Corning公司。β-actin抗體購自 Santa Cruz公司；JAM-A抗體購自Epitomics公司；Cx43購自Cell Signaling公司。辣根酶標記山羊抗兔IgG、山羊抗鼠IgG以及FITC標記山羊抗小鼠IgG、山羊抗兔IgG購自北京中杉金橋生物技術公司。

1．2 ox-LDL的制備 取新鮮人血清，用梯度超速離心法分離低密度脂蛋白。用5μmol·L－1硫酸銅氧化低密度脂蛋白，37℃、16 h后，加1 mmol·L－1EDTA終止氧化。用PBS（pH 7.3）4℃透析24 h，用0.22μm的Millex濾器過濾，4℃儲存備用。

1.3 人臍靜脈內皮細胞的分離與培養 取新鮮臍帶，用0.1%的Ⅰ型膠原酶灌注消化15 min，收集臍靜脈血管內皮細胞，1 000 r·min－1，離心 6 min，用M199培養基（20%胎牛血清、1×105U·L－1青霉素、1×105U·L－1鏈霉素和1%谷氨酰胺）懸浮細胞，接種于培養皿中，37℃、5%CO2孵箱中培養。細胞傳至第3代用于實驗。

1．4 W estern blot方法檢測蛋白表達 實驗前饑餓細胞12 h，分別用銀杏內酯 B（0.2、0.4、0.6 g·L－1）及 LY294002（1、3、10μmol·L－1）孵育 1 h，加入 ox-LDL（0.1 g·L－1）刺激細胞 4 h。去除培養基，用PBS洗兩遍，去除上清，用細胞裂解液RIPA裂解細胞，收集蛋白。采用BCA法測定蛋白濃度。取15μg蛋白樣品，經SDS-PAGE后，濕轉法轉至PVDF膜上。用5%牛血清白蛋白室溫下封閉1 h。分別加入特異性抗體（JAM-A、Cx43、β-actin），4℃孵育過夜。用 TBS-T（100 mmol·L－1Tris，150 mmol·L－1NaCl，0.1%Tween）洗膜3次，每次5 min，加入二抗，室溫孵育1 h。TBS-T洗膜3次，每次5 min。加ECL發光液，用凝膠成像儀成像。

1．5 免疫熒光檢測JAM-A、Cx43在內皮細胞的表達 無菌蓋玻片置于6孔板中，接種細胞。待細胞融合，用含0.5%胎牛血清的M199培養基饑餓細胞12 h，銀杏內酯B孵育細胞1h，ox-LDL刺激細胞4 h。去除培養基，用PBS洗3次，用4%多聚甲醛室溫下固定細胞10 min。然后，PBS洗3次，每次5 min。用5%牛血清白蛋白封閉1 h，一抗（1∶100）孵育，4℃過夜。PBS洗3次，每次5 min，加FITC標記的二抗（1∶100），室溫下避光孵育1 h。PBS洗3次，加 DAPI（1∶1 000）染核5 min，洗3次。用50%甘油封片，熒光顯微鏡下觀察熒光強度，用尼康CCD成像系統成像。實驗重復至少3次。

1.6 白細胞遷移實驗 用collagen包被Transwell小室濾膜外表面，超凈臺內紫外照射3 h，充分干燥。分別在Transwell小室內加入100μl、小室外加入600μl細胞培養基，于細胞培養箱中平衡1 h。去除小室內的培養基，接種100μl細胞懸液（1×109·L－1），培養72 h，實驗前饑餓細胞 12 h。用銀杏內酯B孵育細胞1 h，然后用ox-LDL刺激細胞4 h，加入 U937單核細胞株（1×109·L－1），共培養 24 h。在PBS中浸泡小室后用4%多聚甲醛固定10 min，用0.5%結晶紫染色標識單核細胞30min，PBS洗3次，用PBS浸濕的棉簽輕輕擦拭，去除小室內側的內皮細胞。取下濾膜，置于載玻片上。顯微鏡下隨機取5個視野，計數單核細胞，用CCD成像。實驗重復至少3次。

1.7 統計學方法 蛋白表達的灰度分析數據以ˉx±s表示，采用單因素方差分析studentt檢驗。

2 結果

2．1 銀杏內酯 B對 ox-LDL刺激的內皮細胞JAM-A表達的影響 JAM-A存在于內皮細胞緊密連接處，JAM-A的過表達能夠促進白細胞向血管內膜下遷移。結果顯示，ox-LDL刺激內皮細胞4 h后，JAM-A表達增加了22%，與對照組比較有明顯差異（P＜0.05）。銀杏內酯 B（0.4、0.6 g·L－1）明顯抑制了ox-LDL刺激的內皮細胞JAM-A的表達（P＜0.05）（Fig 1）。我們用免疫熒光法進一步觀察了JAM-A在內皮細胞中的分布。結果顯示，ox-LDL刺激細胞后，JAM-A在胞質及胞膜上表達均明顯增多，0.6 g·L－1銀杏內酯B處理的細胞JAM-A表達基本恢復到正常水平（Fig 2）。

Fig 1 Effect of ginkgolide B on JAM-A expression in ox-LDL-treated HUVECsA：JAM-A expression was detected by Western blot；B：Densitometry analysis of JAM-A expression.Data are representatives of four independent experiments.＃P＜0.05 compared with cells without ox-LDL treatment；*P＜0.05 compared with cells treated with ox-LDL alone

Fig 2 Effect of ginkgolide B on JAM-A expression in ox-LDL-treated HUVECsA：Immunoflurescence staining of JAM-A in HUVECs（green）；B：Staining of HUVECsnuclearwith DAPI（blue）；C：Merged images combining the green immunoflurescence of JAM-A with the blue-nuclear staining（×400）.

2．2 銀杏內酯B對ox-LDL刺激的內皮細胞Cx43表達的影響 Cx43是細胞膜上介導炎癥細胞／蛋白通過的縫隙連接蛋白。結果顯示，ox-LDL刺激內皮細胞，Cx43表達增加了24%（P＜0.05）。銀杏內酯B以劑量依賴的方式抑制了Cx43表達，0.4 g·L－1和0.6 g·L－1濃度的銀杏內酯B減少了Cx43的表達（P＜0.05）（Fig 3）。同樣，我們用免疫熒光方法進一步證實，ox-LDL刺激后Cx43在細胞膜上表達明顯增多，而0.6 g·L－1銀杏內酯B處理后，Cx43在膜上的表達減少到基礎水平（Fig 4）。

2．3 LY294002對ox-LDL刺激內皮細胞JAM-A、Cx43表達的影響 最近，我們報道了銀杏內酯B能夠抑制Akt磷酸化，減少內皮細胞炎癥反應。LY294002是PI3K特異性抑制劑，首先我們確認了其能夠抑制內皮細胞的Akt磷酸化（Fig 5，A、B），進一步探討了Akt活化是否影響JAM-A、Cx43的表達。結果顯示，LY294002（10μmol·L－1）明顯抑制了ox-LDL刺激的JAM-A、Cx43表達（P＜0.05）（Fig 5，C、D、E、F）。這一結果提示，銀杏內酯 B抑制ox-LDL刺激的內皮細胞JAM-A、Cx43的表達可能與抑制Akt信號通路相關。

Fig 3 Effect of ginkgolide B on Cx43 expression in ox-LDL-treated HUVECsA：Cx43 expression was detected by Western blot；B：Densitometry analysis of Cx43 expression.Data are representatives of four independent experiments.＃P＜0.05 compared with cells without ox-LDL treatment；*P＜0.05 compared with cells treated with ox-LDL alone.

Fig 4 Effect of ginkgolide B on Cx43 expression in ox-LDL-treated HUVECsA：Immunoflurescence staining of Cx43 in HUVECs（green）；B：Staining of HUVECs nuclear with DAPI（blue）；C：Merged images combining the green immunoflurescence of Cx43 with the blue-nuclear staining（×400）.

Fig 5 Effect of LY294002 on JAM-A and Cx43 expressions in ox-LDL-treated HUVECsA，C，E：Akt phosphorylation，JAM-A and Cx43 expressionswere detected by Western blot.B，D，F：Densitometry analysis of Akt phosphorylation，JAM-A and Cx43 expressions.Data are representativesof four independentexperiments.＃P＜0.05 compared with cellswithoutox-LDL treatment；*P＜0.05 compared with cells treated with ox-LDL alone.

2．4 銀杏內酯B對白細胞遷移的影響 內皮細胞連接蛋白功能損傷能夠使炎癥蛋白以及炎癥細胞向血管內膜下遷移，血管滲透性增加。因此，我們觀察了銀杏內酯B對減少炎癥細胞的浸潤／遷移的作用。我們用Transwell實驗，觀察了銀杏內酯B對ox-LDL刺激內皮細胞損傷時單核細胞的遷移情況。結果顯示，與未經任何處理的內皮細胞比較，ox-LDL刺激內皮細胞后，單核細胞向Transwell小室外遷移的數量增多。銀杏內酯B（0.6 g·L－1）處理的細胞，單核細胞遷移數量明顯減少（Fig 6）。表明銀杏內酯B能夠通過抑制連接蛋白JAM-A、Cx43的表達，減少白細胞遷移，改善血管滲透性。

Fig 6 Effect of ginkgolide B on monocyte transm igration across HUVECsA：Effect of ginkgolide B on monocyte transmigration across HUVECs（×200）；B：Quantitative analysis of U937 transmigration.Data are representatives of four independent experiments.＃P＜0.05 compared with cells without ox-LDL treatment；*P＜0.05 compared with cells treated with ox-LDL alone

3 討論

動脈粥樣硬化是復雜的慢性血管炎癥性疾病，內皮細胞損傷是動脈粥樣硬化過程中的早期表現。正常狀態下，血管內皮細胞之間通過緊密連接、黏著連接、縫隙連接等構成血管壁屏障，阻止循環中的有害因子向血管內膜下滲透。病理狀態下，內皮細胞連接功能受損，血管通透性增強，導致炎癥分子以及炎癥細胞穿透血管屏障向血管內膜下聚集，促進血管炎癥反應。

JAM-A是緊密連接相關蛋白，屬于小分子IgG超家族，在內皮細胞、上皮細胞、白細胞、血小板等多種細胞表面均有表達。JAM-A通過與不同配體結合發揮多種功能。內皮細胞表面的JAM-A通過與相鄰細胞的JAM-A相互作用構成緊密連接屏障［5］。病理狀態下，血小板表面的JAM-A與內皮細胞表面的JAM-A相互作用，介導血小板與內皮細胞黏附。利用siRNA技術沉默人臍靜脈內皮細胞的JAM-A基因，血小板黏附于炎癥內皮細胞的能力明顯減弱［6］。此外，JAM-A還參與白細胞經細胞旁途徑滲透到血管內膜下的過程［7-8］，這一過程可能是由內皮細胞表面的JAM-A與白細胞表面的配體LFA-1結合實現的［9］。內皮細胞是血管壁的第一道屏障，病理狀態下內皮細胞損傷時，JAM-A介導內皮細胞與血小板黏附、白細胞遷移反應。Cx43是構成縫隙連接的基本單位，縫隙連接通訊結構功能異常在動脈粥樣硬化斑塊形成中具有重要作用［10］。研究表明，Cx43的過表達可能參與了白細胞向血管內膜下浸潤的過程［11-12］。動物實驗提示，利用藥物或基因療法降低內皮細胞Cx43的表達能明顯抑制動脈粥樣硬化的進展［13］。Wei等［14］報告了銀杏葉提取物EGb761能抑制內皮細胞Cx43的表達。

銀杏內酯B是中藥銀杏葉的提取物成分之一，為血小板活化因子受體拮抗劑，具有抑制血小板功能、抗動脈粥樣硬化的作用［15］。本研究的結果提示，ox-LDL刺激內皮細胞JAM-A、Cx43的表達明顯增多，而銀杏內酯B能夠下調JAM-A、Cx43的表達。PI3K／Akt信號通路與多種炎癥反應有關，參與調控單核細胞向血管內膜下遷移浸潤［16］。我們先前的研究表明，銀杏內酯B能通過抑制PI3K／Akt信號通路的激活，抑制血小板活化，減少血小板及內皮細胞炎癥蛋白 PF4、CD40L、ICAM-1等表達［17］。本研究進一步證實，抑制Akt磷酸化同樣能夠抑制ox-LDL刺激內皮細胞連接蛋白的表達。表明Akt是銀杏內酯B藥理作用的一個重要靶點。此外，我們通過Transwell實驗證實，銀杏內酯B減少單核細胞向損傷的內皮細胞下遷移。這些結果表明銀杏內酯B能夠通過改善內皮細胞連接蛋白功能，改善血管滲透性。

綜上所述，銀杏內酯B能降低ox-LDL刺激內皮細胞JAM-A、Cx43表達，改善內皮細胞連接蛋白功能，從而改善血管滲透性。這一藥理學效應可能與抑制PI3K／Akt信號通路有關。本研究為銀杏內酯B抗動脈粥樣硬化的研究提供了新的理論和實驗依據，具有重要的科學意義。

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