丹皮酚對(duì)脂多糖／三磷酸腺苷誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞NLRP3炎癥小體激活的影響

王 偉，戴 敏，徐忠東

（1.合肥師范學(xué)院生命科學(xué)系，安徽合肥 230601；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽省中藥研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，省部共建新安醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽合肥 230038）

小膠質(zhì)細(xì)胞（microglia，MG）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要的免疫活性細(xì)胞，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮核心作用［1］。近來研究表明，小膠質(zhì)細(xì)胞中NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3（NOD-like receptor family，pyrin domain-containing 3，NLRP3）炎癥小體的異常激活在阿爾采末病（Alzheimer’s disease，AD）和多發(fā)性硬化癥（multiple sclerosis，MS）等神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生和發(fā)展過程中起重要作用［2－3］。NLRP3炎癥小體能夠被包括微生物毒素和β淀粉樣蛋白（β-amyloid，Aβ）在內(nèi)多種物質(zhì)激活，其激活后通過與其接頭蛋白凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD，ASC）相互作用，招募半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1前體（pro-cysteinyl aspartate specific protease-1，pro-caspase-1），形成蛋白復(fù)合物“炎癥小體”，進(jìn)而對(duì)白細(xì)胞介素-1β前體（pro-interleukin-1 beta，pro-IL-1β）發(fā)揮功能［4］。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，生理濃度的IL-1β能保護(hù)神經(jīng)元免遭興奮性氨基酸毒性的損傷，然而過多的、持續(xù)的IL-1β產(chǎn)生，則對(duì)神經(jīng)細(xì)胞具有明顯的損傷作用［5］。因此，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞NLRP3炎癥小體激活對(duì)治療AD等神經(jīng)退行性疾病具有重要意義。

丹皮酚（paeonol，Pae）是牡丹根皮及蘿摩科徐長(zhǎng)卿（Cynanchum paniculatiumKrrag）的主要活性成分之一，具有祛瘀止血、抗菌消炎、鎮(zhèn)靜解痙、退熱止痛等廣泛的藥理作用。既往研究表明［6］，Pae可通過絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）和核因子-κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）信號(hào)途徑抑制脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞（BV-2）和巨噬細(xì)胞（RAW 264.7）腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）和 IL-1β的生成及釋放。我們前期研究發(fā)現(xiàn)［7］，Pae能抑制TNF-α誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞炎性因子的表達(dá)，減輕細(xì)胞炎癥反應(yīng)。上述研究提示Pae具有良好的抑制細(xì)胞炎癥反應(yīng)作用，然而，其是否通過調(diào)節(jié)NLRP3炎癥小體而抑制小膠質(zhì)細(xì)胞炎性因子的釋放目前仍不清楚。因此，本研究采用LPS與三磷酸腺苷（adenosine 5′-triphosphate，ATP）誘導(dǎo)的大鼠原代小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥小體激活模型，從NLRP3炎癥小體途徑觀察Pae對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)的抑制作用及其具體機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物和主要試劑 新生SD大鼠（出生24 h內(nèi)），動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（皖）2005-001，安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。Pae（純度99%）、LPS、ATP、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）和細(xì)胞ROS熒光探針（DCFH-DA）購于Sigma公司，Pae用DMSO溶解；DMEM／F12培養(yǎng)基和胎牛血清購于Gibco公司；細(xì)胞裂解液和BCA蛋白定量試劑盒購于江蘇碧云天生物技術(shù)有限公司；CD11b抗體購于Abcam公司；NLRP3、ASC、caspase-1和 GAPDH抗體購于Santa Cruz公司；Alexa Fluor 488標(biāo)記的熒光二抗購自Invitrogen公司；IL-1βELISA檢測(cè)試劑盒購自北京達(dá)科為生物技術(shù)有限公司；其余所用試劑均為化學(xué)分析純。

1.2 原代大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng) 無菌條件下取出新生大鼠大腦，用眼科鑷去除大腦表面血管和腦膜，并將皮質(zhì)剝離，用眼科剪將大腦皮質(zhì)剪碎成1 mm3的組織塊，置入含0.25%胰蛋白酶的消化液在37℃條件下消化30 min，血清終止消化，充分吹打成單細(xì)胞懸液，1 000 r·min－1離心 10 min，棄上清，用含10%胎牛血清的DMEM／F12培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，以1×108個(gè)·L－1接種于75 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每隔2～3天換液1次。14 d后將培養(yǎng)瓶旋緊密封，于37℃的恒溫?fù)u床中以200 r·min－1的速度振搖12 h，收集培養(yǎng)液，1 000 r·min－1離心 10 min，棄上清，用含 10%胎牛血清的DMEM／F12培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種培養(yǎng)板置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育備用。

1.3 小膠質(zhì)細(xì)胞鑒定 將小膠質(zhì)細(xì)胞接種到含無菌玻片的培養(yǎng)孔內(nèi)，細(xì)胞貼壁后取出玻片，PBS沖洗3次，4%多聚甲醛固定，5%山羊血清室溫封閉30 min，兔抗大鼠 CD11b（1∶50）4℃過夜，再加入山羊抗兔二抗（1∶200），室溫避光孵育1 h，0.01%DAPI復(fù)染細(xì)胞核，抗熒光淬滅封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組及給藥方法 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的小膠質(zhì)細(xì)胞以2×108個(gè)·L－1濃度接種96孔板，進(jìn)行ELISA實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞內(nèi)ROS水平的測(cè)定；以2×1010個(gè)·L－1濃度接種6孔板，進(jìn)行Western blot檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)分組，①對(duì)照組：加入含10%胎牛血清的DMEM／F12培養(yǎng)基；②模型組：加入含0.5 mg·L－1LPS的培養(yǎng)基作用24 h后，5 mmol·L－1ATP繼續(xù)作用45 min；③Pae組：不同濃度 Pae（2.5、5、10μmol·L－1）首先作用細(xì)胞 1 h，然后加入 LPS（0.5 mg·L－1）作用細(xì)胞 24 h，5 mmol·L－1ATP繼續(xù)作用 45 min。細(xì)胞模型處理?xiàng)l件和藥物濃度選擇依據(jù)文獻(xiàn)和預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果［8－9］。

1．5 ELISA法測(cè)定小膠質(zhì)細(xì)胞上清液中IL-1β含量 小膠質(zhì)細(xì)胞按分組處理24 h后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液。1 500 r·min－1離心，取上清，ELISA法測(cè)定IL-1β濃度。操作步驟按說明書進(jìn)行。在450 nm波長(zhǎng)讀取OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品濃度。

1．6 Western blot檢測(cè)細(xì)胞NLRP3、ASC、caspase-1蛋白水平 小膠質(zhì)細(xì)胞按分組處理24 h后，每孔細(xì)胞加入150μl細(xì)胞裂解液，冰上裂解10 min。在12 000 r·min－1、4℃條件下離心 20 min，獲得上清液，用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。蛋白經(jīng)10%SDS-PAGE電泳分離后，用300 mA電流將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，在5%脫脂奶粉中封閉1 h，在不同的一抗（1∶1 000）中孵育過夜（4℃）。PVDF膜經(jīng)0.5%TBS-T溶液洗膜3次，再與HRP標(biāo)記的二抗（1∶5 000）進(jìn)行反應(yīng)。用0.5%TBS-T溶液洗膜3次，ECL化學(xué)發(fā)光法顯影，X光膠片壓片曝光，用Image J軟件分析電泳條帶灰度值。

1．7 細(xì)胞內(nèi)ROS水平測(cè)定 細(xì)胞內(nèi)ROS水平測(cè)定參照文獻(xiàn)方法檢測(cè)［10］。小膠質(zhì)細(xì)胞按分組處理24 h后，棄去上清液，PBS清洗2遍，加入DCFH-DA（5μmol·L－1）37℃避光孵育30 min，用 PBS清洗2遍，TECAN多功能酶標(biāo)儀（激發(fā)和吸收波長(zhǎng)分別為：485 nm和530 nm）讀取熒光光強(qiáng)度，結(jié)果以熒光強(qiáng)度（AU）表示。

2 結(jié)果

2.1 小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察和鑒定 培養(yǎng)10 d后，混合膠質(zhì)細(xì)胞基本融合，相差顯微鏡下可見少量小膠質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)于星形膠質(zhì)細(xì)胞層上方，其胞體較小、折光性強(qiáng)、突起短?。‵ig 1A）。培養(yǎng)14 d后，相差顯微鏡下可見大量膠質(zhì)細(xì)胞（Fig 1B），此時(shí)采取震蕩法純化小膠質(zhì)細(xì)胞。細(xì)胞鑒定采用小膠質(zhì)細(xì)胞表面特異性標(biāo)志CD11b單克隆抗體進(jìn)行免疫染色，熒光顯微鏡下可見細(xì)胞膜上有明顯的綠色熒光，符合細(xì)胞膜分布特點(diǎn)，證實(shí)為小膠質(zhì)細(xì)胞（Fig 1C）。

2．2 Pae對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞IL-1β分泌的影響 如Fig 2所示，同對(duì)照組相比，模型組細(xì)胞上清液中IL-1β水平明顯升高；同模型組相比，Pae各濃度組呈劑量依賴性抑制小膠質(zhì)細(xì)胞IL-1β分泌，表明Pae對(duì)LPS＋ATP誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞IL-1β分泌具有明顯的抑制作用。

Fig 1 Identification of primary ratm icroglia（A）Primary cultured ratmicroglia for 10 days（×200）；（B）Primary cultured ratmicroglia for14 days（×200）；（C）Immunocytochemistry of CD11b-DAPIdouble staining in primary ratmicroglia（×100）

Fig 2 Effect of paeonol on IL-1βlevels in cultured supernatant of LPS／ATP induced primary ratm icroglia**P＜0.01 vs control；＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs model

2．3 Pae對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞NLRP3炎癥小體的影響如Fig 3所示，同對(duì)照組相比，模型組細(xì)胞NLRP3、ASC和caspase-1蛋白水平明顯升高；同模型組相比，Pae中、高濃度組能明顯抑制LPS＋ATP上調(diào)的小膠質(zhì)細(xì)胞NLRP3、ASC和caspase-1蛋白水平，表明Pae可能通過抑制NLRP3炎癥小體激活，從而減輕LPS＋ATP誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)。

2．4 Pae對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞ROS水平的影響 如Fig 4所示，同對(duì)照組相比，模型組細(xì)胞內(nèi)ROS水平明顯升高；同模型組相比，Pae各濃度組能明顯抑制LPS＋ATP誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞ROS水平，表明Pae可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)ROS水平，從而抑制LPS＋ATP誘導(dǎo)的NLRP3炎癥小體激活。

Fig 3 Effect of paeonol on NLRP3，ASC and caspase-1 expression levels in LPS／ATP induced primary ratm icroglia**P＜0.01 vs control；＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs model

Fig 4 Effect of paeonol on ROS levels in LPS／ATP induced primary ratm icroglia**P＜0.01 vs control；＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs model

3 討論

炎癥小體最初被發(fā)現(xiàn)是在固有免疫反應(yīng)中，作為機(jī)體防御病原體重要機(jī)制之一，其家族成員NLRP3近來在神經(jīng)退行性疾病研究中受到了極高的關(guān)注。在Cuprizone誘導(dǎo)的小鼠MS模型中發(fā)現(xiàn)，通過敲除小鼠NLRP3基因能夠明顯延遲神經(jīng)炎癥反應(yīng)［3］。在AD發(fā)病機(jī)制的研究中發(fā)現(xiàn)，Aβ能夠激活小膠質(zhì)細(xì)胞NLRP3炎癥小體［11］，伴隨而來的IL-1β釋放增多能夠進(jìn)一步加重這種神經(jīng)退行性疾?。?2］。此外，在對(duì)嘌呤受體P2X配體門控性離子通道7（P2X purinoceptor 7，P2X7R）特 異 性 拮 抗 劑GSK1370319A藥理作用的研究中發(fā)現(xiàn)，GSK1370319A通過抑制P2X7R介導(dǎo)的膠質(zhì)細(xì)胞NLRP3炎癥小體的激活和隨后的IL-1β的釋放，起到中樞神經(jīng)系統(tǒng)保護(hù)作用［8］。上述研究提示，NLRP3炎癥小體有可能成為治療神經(jīng)退行性疾病新的藥物靶點(diǎn)。

目前，體外小膠質(zhì)細(xì)胞NLRP3炎癥小體激活模型的建立主要是通過雙信號(hào)系統(tǒng)，首先由第一信號(hào)LPS活化小膠質(zhì)細(xì)胞，然后由高濃度ATP作為第二信號(hào)通過P2X7R激活NLRP3炎癥小體［13］。與既往報(bào)道一致［8］，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ATP能上調(diào)LPS活化的小膠質(zhì)細(xì)胞中NLRP3、ASC和caspase-1蛋白水平，增加細(xì)胞上清液中IL-1β水平，表明小膠質(zhì)細(xì)胞NLRP3炎癥小體激活模型建立成功。此外，我們也發(fā)現(xiàn)LPS和ATP作用小膠質(zhì)細(xì)胞24 h后，能明顯提升細(xì)胞內(nèi)ROS水平。細(xì)胞內(nèi)ROS水平的升高目前已經(jīng)證明參與激活NLRP3炎癥小體，并且ROS的抑制劑或清除劑能抑制NLRP3炎癥小體的激活［14］。因此，我們推測(cè)細(xì)胞內(nèi) ROS水平的升高也參與了LPS和ATP雙信號(hào)激活的小膠質(zhì)細(xì)胞NLRP3炎癥小體。

Pae在神經(jīng)退行性疾病中的治療作用逐漸受到關(guān)注。在Aβ誘導(dǎo)的AD大鼠模型中發(fā)現(xiàn)，Pae能明顯改善模型大鼠行為學(xué)指標(biāo)［15］。在D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，Pae能減少模型小鼠氧化應(yīng)激、緩解海馬及顳葉皮層神經(jīng)元損傷、改善學(xué)習(xí)和記憶能力［16］。體外研究發(fā)現(xiàn)，Pae能通過抑制MAPK和NF-κB信號(hào)途徑減少LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞炎性因子 IL-1β的釋放［6］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Pae能抑制LPS和ATP雙信號(hào)上調(diào)的NLRP3、ASC和caspase-1蛋白水平，減少細(xì)胞上清液中IL-1β濃度，表明Pae能抑制LPS和ATP誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞NLRP3炎癥小體的激活。在本實(shí)驗(yàn)中，我們還發(fā)現(xiàn)Pae能下調(diào)模型組ROS水平，提示Pae可能通過下調(diào)細(xì)胞內(nèi)ROS水平抑制小膠質(zhì)細(xì)胞NLRP3炎癥小體的激活。此外，在小膠質(zhì)細(xì)胞中，Pae已被證明能抑制LPS誘導(dǎo)的NF-κB激活［6］。有研究表明，激活的NF-κB能上調(diào)NLRP3基因表達(dá)而參與激活NLRP3炎癥小體［17］。因此，我們推測(cè)Pae除下調(diào)小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)ROS水平外，還可能通過NF-κB信號(hào)途徑抑制NLRP3炎癥小體激活。然而，有關(guān)Pae對(duì)NLRP3炎癥小體調(diào)控的具體機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)Pae能抑制LPS和ATP雙信號(hào)激活的小膠質(zhì)細(xì)胞NLRP3炎癥小體，減少細(xì)胞上清液IL-1β水平，Pae對(duì)NLRP3炎癥小體抑制作用可能與其下調(diào)小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)ROS水平有關(guān)。本研究初步揭示了Pae抑制小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)的分子作用機(jī)制，為進(jìn)一步研究Pae防治神經(jīng)退行性疾病提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

［1］ Banati R B，Gehrmann J，Schubert P，Kreutzberg GW.Cytotoxicity ofmicroglia［J］.Glia，1993，7（1）：111－8.

［2］ 武冬慧，胡金鳳，宋修云，等.小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的受體與阿爾采末病［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2010，26（12）：1550－3.

［2］ Wu D H，Hu JF，Song X Y，et al.The receptors expression in microglia and Alzheimer’s disease［J］.Chin Pharmacol Bull，2010，26（12）：1550－3.

［3］ Jha S，Srivastava SY，Brickey W J，et al.The inflammasome sensor，NLRP3，regulates CNS inflammation and demyelination via caspase-1 and interleukin-18［J］.J Neurosci，2010，30（47）：15811－20.

［4］ Tschopp J，Schroder K.NLRP3 inflammasome activation：The convergence ofmultiple signalling pathways on ROS production［J］？Nat Rev Immunol，2010，10（3）：210－5.

［5］ Boutin H，LeFeuvre R A，Horai R，et al.Role of IL-1alpha and IL-1 beta in ischemic brain damage［J］.J Neurosci，2001，21（15）：5528－34.

［6］ Himaya SW，Ryu B，Qian Z J，Kim S K.Paeonol from hippocampus kuda Bleeler suppressed the neuro-inflammatory responsesin vitrovia NF-kappa B and MAPK signaling pathways［J］.Toxicol In Vitro，2012，26（6）：878－87.

［7］ Pan L L，Dai M.Paeonol from Paeonia suffruticosa prevents TNF-alpha-induced monocytic cell adhesion to rat aortic endothelial cells by suppression of VCAM-1 expression［J］.Phytomedicine，2009，16（11）：1027－32.

［8］ Murphy N，Cowley T R，Richardson JC，et al.The neuroprotective effect of a specific P2X（7）receptor antagonist derives from its ability to inhibit assembly of the NLRP3 inflammasome in glial cells［J］.Brain Pathol，2012，22（3）：295－306.

［9］ Tseng Y T，Hsu Y Y，Shih Y T，Lo Y C.Paeonol attenuatesmicroglia-mediated inflammation and oxidative stress-induced neurotoxicity in rat primary microglia and cortical neurons［J］.Shock，2012，37（3）：312－8.

［10］李文明，劉洪濤，李秀英，等.川芎嗪對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的影響［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2009，25（11）：1516－21.

［10］LiW M，Liu H T，Li X Y，etal.Effectof tetramethylpyrazine on lipopolysaccharide-induced damage in vascular endothelial cell［J］.Chin Pharmacol Bull，2009，25（11）：1516－21.

［11］Halle A，Hornung V，Petzold G C，et al.The NALP3 inflammasome is involved in the innate immune response to amyloid-beta［J］.Nat Immunol，2008，9（8）：857－65.

［12］Salminen A，Ojala J，Suuronen T，et al.Amyloid-beta oligomers set fire to inflammasomes and induce Alzheimer′s pathology［J］.J Cell Mol Med，2008，12（6A）：2255－62.

［13］Gombault A，Baron L，Couillin I.ATP release and purinergic signaling in NLRP3 inflammasome activation［J］.Front Immunol，2012，3：414.

［14］Dostert C，Petrilli V，Van Bruggen R，et al.Innate immune activation through Nalp3 inflammasome sensing of asbestos and silica［J］.Science，2008，320（5876）：674－7.

［15］Zhou J，Zhou L，Hou D，et al.Paeonol increases levels of cortical cytochrome oxidase and vascular actin and improves behavior in a ratmodel of Alzheimer′s disease［J］.Brain Res，2011，1388：141－7.

［16］Zhong S Z，Ge Q H，Qu R，et al.Paeonol attenuates neurotoxicity and ameliorates cognitive impairment induced by d-galactose in ICRmice［J］.JNeurol Sci，2009，277（1－2）：58－64.

［17］Bauernfeind FG，Horvath G，Stutz A，etal.Cutting edge：NF-kappa B activating pattern recognition and cytokine receptors license NLRP3 inflammasome activation by regulating NLRP3 expression［J］.J Immunol，2009，183（2）：787－91.