低氧誘導因子-3α的研究進展

鹿 輝，尹 強，王 榮，謝 華，李文斌，賈正平，張娟紅

（蘭州軍區蘭州總醫院全軍高原損傷防治重點實驗室，甘肅蘭州 730050）

低氧誘導因子（hypoxia-inducible transcription factor，HIF）最早是由Semenza等［1］于1992年在研究促紅細胞生成素基因時發現的。HIF是細胞應對氧氣水平降低時的主要調節因子，調控依賴氧氣水平相關基因的表達［2］。這些基因主要參與造血、血管生成、離子轉運、葡萄糖的利用、細胞外基質的合成、細胞的增殖、生存及凋亡和腫瘤的發生等過程［3－4］。HIF是由一個不穩定的 α亞基（HIF-α）和一個穩定的β亞基（HIF-β）組成的二聚體，具有結合靶基因的低氧反應元件（hypoxia response elements，HREs）的能力，從而發揮調控作用。HIF-α和HIF-β亞基均屬于 bHLH-PAS（bHLH，basic helix-loop-helix；PAS，Per-ARNT-Sim；Per，period circadian protein；ARNT，aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator protein；Sim，single-minded protein）蛋白家族的成員［5］。序列同源性HIF-α亞基在人體中目前認為有3種：HIF-1α（由基因 HIF1A編碼）、HIF-2α（由基因 EPAS1編碼）和HIF-3α（由基因HIF3A編碼HIF-3α的多種剪接變異體）［6］，三者均受氧濃度調節，是調節HIF活性的功能亞單位［8］。。相對于HIF-1α和HIF-2α，對HIF-3α的認識和研究還比較匱乏。HIF-3α存在多種剪切變異體，其功能也不盡相同，調控包括低氧應激在內的多種生理活動。本綜述將系統地介紹HIF-3α的結構、表達調控及其在多種生理活動中的調控作用。

1 HIF-3α的結構

HIF-1α和HIF-2α亞基具有相似的結構域，均具有1個N端bHLH結構域，2個PAS結構域，氧氣依賴降解結構域（oxygen-dependent degradation domain，ODD）以及 N端和 C端的轉錄激活結構域（transactivation domain，TAD）組成，N端的TAD結構域的部分序列與ODD重疊［9］。1998年，在老鼠體內首次發現了HIF-α的第3種亞型HIF-3α［10］，在人體內于2001年首次發現HIF-3α［11］。這種新的蛋白與HIF-1α和HIF-2α的bHLH-PAS區域有55%的相似性［10］。與HIF-1α和HIF-2α相似，HIF-3α中也含有1個ODD結構域和1個N-TAD結構域，但沒有C-TAD結構域（Fig 1）。

Fig 1 Structural alignment of human HIF-1α，HIF-2α and HIF-3αsubunits

2 人類 HIF-3α（hHIF-3α）的剪接變異體

人類HIF-3α（hHIF-3α）有8種剪接變異體，其結構域見Fig 2，與鼠 HIF-3α（mHIF-3α）相似，人類 HIF-3α基因包含19個內含子，長度大約是43 kb的堿基長度，位于染色體的19q13.2的位置。3個特別的外顯子1a、1b和1c很可能含有8種剪接變異體的轉錄起始位點。外顯子2編碼bHLH結構域，外顯子3-9編碼PASa、PASb和PAC（PAS-associated C-terminal domain）結構域，外顯子11的3′末端部分、整個的外顯子12和外顯子13的5′末端部分編碼ODD結構域，外顯子14a和16編碼亮氨酸拉鏈結構域（leucinezipper，LZIP）［6］。

hHIF-3α1的序列從外顯子1c開始，到外顯子16終止。hHIF-3α1編碼668個氨基酸長度的蛋白質，含有N-TAD結構域，但并不含有C-TAD結構域。有趣的是，與HIF-1α、HIF-2α及其他hHIF-3α的變異體不同的是，hHIF-3α1含有獨特的亮氨酸拉鏈（leucine zipper，LZIP）結構域。LZIP結構具有介導與DNA結合和蛋白質－蛋白質相互作用的功能。hHIF-3α1的另外一個特殊的結構是，在ODD和LZIP結構域的上游具有LXXLL（Leu-Xaa-Xaa-Leu-Leu）基序。LXXLL基序主要在核受體的共因子中發現，是蛋白質相互作用的位點。LZIP和LXXLL結構在HIF-1α和HIF-2α中都不存在，表明hHIF-3α1可能具有結合啟動子序列的能力或者結合不被HIF-1α和HIF-2α識別的新蛋白質的能力。hHIF-3α2從外顯子1a開始，終止于外顯子13a，不包含外顯子1b和1c，編碼632個氨基酸長度的蛋白質。hHIF-3α2的結構與hHIF-3α1非常相似，但缺少LZIP結構域及其上游的LXXLL基序。hHIF-3α4從外顯子1a開始，終止于不完整的內含子8，內含子7沒有被剪切掉。編碼363個氨基酸長度的蛋白質，只含有 bHLH、PASa和 PASb結構域，缺少 N-TAD、CTAD、ODD和LZIP結構域及LXXLL基序，表明hHIF-3α4可能作為hHIF調控系統的負調控因子。hHIF-3α6從外顯子1b開始，缺少外顯子3和hHIF3α4相似，含有內含子7并終止于內含子8，hHIF-3α6蛋白只包含 C末端的結構域PASb。hHIF-3α7和 hHIF-3α8結構相似，但 hHIF-3α7缺少LZIP結構域。hHIF-3α9和 hHIF-3α1結構相似，差別僅在于外顯子1的不同。值得注意的是hHIF-3α10，其編碼序列被內含子1所阻斷，因此僅編碼7個氨基酸［6－7］。

Fig 2 Multiple spliced variants of the human HIF-3α，Asterisk represents the conserved LXXLL motif

3 HIF-3α的基因表達

急性缺氧（12%O2，2 h）對 HIF-1α、HIF-2α和 HIF-1β的mRNA水平在心、肺、腎和骨骼肌組織中的表達沒有明顯的影響，但在上述組織中卻強烈地誘導HIF-3α的mRNA表達。雖然5個星期的間歇性缺氧訓練（intermittent hypoxic training，IHT）可以誘導HIF-3α的mRNA在上述組織的上調表達，但是IHT后的急性缺氧除了在骨骼肌組織可以誘導HIF-3α的mRNA表達上調外，在其他組織中HIF-3α的mRNA都沒有被誘導。這說明IHT抑制了急性缺氧在心、肺、腎組織中對 HIF-3α的mRNA的誘導作用［12］。hHIF-3α4被認為是hHIF調控系統的負調控因子。在低氧的刺激下，HIF調控的基因將會被激活從而應對由缺氧造成的細胞損傷，作為HIF系統的負調控因子hHIF-3α4將會是被抑制的。在缺氧4 h的條件下，利用實時定量PCR測定HepG2肝癌細胞和HEK293A人胚腎細胞中內源性的hHIF-3α4的表達水平，與對照組相比分別降低了75%和50%［13］。這說明hHIF-3α4作為HIF系統的負調控因子，在低氧狀態下是被抑制的，從而使細胞能夠表達氧應激相關基因來應對低氧應激。大鼠mHIF-3α（mHIF-3α）的mRNA水平可在急性缺氧的情況被誘導表達。

令人感到興奮的是，mHIF-3α除了被低氧誘導外，還可以被其他因素誘導。文獻報道［14］，mHIF-3α可以由胰島素和2-脫氧-D-葡萄糖誘導表達。這提示，mHIF-3α除具有參與低氧應激的功能外，還可能具有其他方面的功能，例如可能在糖代謝的調節方面發揮重要的作用。

4 HIF3α4的負調控作用

HIF-3α4缺少N-TAD、C-TAD和 ODDD結構域，因此被認為是HIF系統的負調控因子。文獻報道，HIF-3α4可以與HIF-1α結合，從而降低了 HIF1復合物的水平，對hHIF-1α起負調控的作用。HIF-3α4可以抑制HIF-1α／HIF-β復合物與靶基因HREs序列區的結合，從而抑制了HIF-1α調控的相關基因的表達，起到負調控的作用［13］。利用HEK293A研究發現，HIF-3α4可以與HIF-2α相結合，從而降低HIF2復合物的量，降低HIF-2α的調節作用。研究表明，HIF-3α4與HIF-2α相結合后將明顯降低HIF-2α與靶基因HREs序列區的結合，從而抑制了相關基因的表達，起到負調控的作用［15］。HIF-3α4也可以與 HIF-β相結合，可以同時減少體內HIF1和HIF2復合物的量，對HIF-1α和HIF-2α同時起到負調控作用［13，15］。

5 HIF-3α在肺發育過程中的作用

肺的發育是在相對缺氧的條件下進行的，HIF信號通路在肺的發育過程中起了重要的作用。基因HIF3α／NEPAS／IPAS的缺失會導致剛出生小鼠肺重塑功能的缺損［16］。在小鼠肺上皮細胞中表達HIF-3α會導致后期支氣管形態的缺陷、肺泡的數量降低和改變上皮細胞類型的分化。實驗表明，HIF-3α基因的表達，會使Clara細胞、肺泡Ⅰ型和Ⅱ型細胞的數量有所減少，也使基底細胞處在非經典的空間位置。HIF-3α在小鼠的肺的發育過程中發揮作用，主要的機制是選擇性地抑制了HIF-2α基因的表達，并上調Sox2、Rarβ和Foxp2基因的表達［17］。Sox2基因可以直接影響基底細胞的外形［18］，Rarβ基因敲除小鼠表現為肺泡提前分隔，肺泡數量也是正常小鼠的兩倍。所以，HIF-3α上調Rarβ基因，從而抑制了小鼠的肺在發育過程中肺泡數量的增加。Foxp2基因具有抑制Ccsp和遠端上皮細胞標記（Spc，T1α）的表達作用［19］。這解釋了HIF-3α表達后，Clara細胞、肺泡Ⅰ型和Ⅱ型細胞數量減少的原因。

6 HIF-3α在脂肪細胞分化中的作用

HIF-3α除了在肺的發育過程中發揮重要的作用之外，在其他組織的發育過程中也具有重要的作用。HIF-3α在3T3-L1細胞的脂肪細胞分化過程中被誘導表達，說明可能是脂肪細胞分化的促進因子，在脂肪細胞的分化過程中發揮重要的作用。基因芯片分析實驗表明，當HIF-3α過量表達時，兩個已知的脂肪細胞分化相關基因，aP2和AMPKγ1表達是上調的。脂肪細胞分化相關基因的表達上調，可能是由于HIF-3α的LZIP結構域能夠激活脂肪細胞相關基因的表達造成的［20］。

7 HIF-3α在增強耐力中的負調控作用

抑制HIF-3α的mRNA水平將明顯提高大鼠的身體耐力。除了IHT可以抑制HIF-3α的mRNA水平外，耐力訓練（endurance training，ET）也可以抑制 HIF-3α的 mRNA水平。實驗表明大鼠的HIF-3α的mRNA水平在ET聯合IHT時只有空白對照組的15%，只進行ET時為對照組的30%。IHT后的ET訓練，大鼠表現出最高的身體耐力水平。利用RNA干擾技術，在大鼠的比目魚肌和腓腸肌中抑制HIF-3α的表達，可以明顯的提高大鼠的身體耐力。這說明HIF-3α在大鼠身體耐力增強中具有重要的負調控作用［12］。

8 HIF-3α4在腦膜瘤中的作用

腦膜瘤是血管最豐富的腦瘤之一，有效抑制腦膜瘤的血管生成是一種有效的新療法。HIF-1α和HIF-2α在腫瘤的血管生成中具有重要的作用，而HIF-3α4被認為是上述兩個α亞基的負調控因子。最近的研究表明，在腦膜瘤中HIF-3α4的表達是受到抑制的，這是由于 HIF-3α4的啟動子區DNA的甲基化導致的。在富血管腦膜瘤中誘導HIF-3α4高表達，可以有效地抑制腦膜瘤的血管生成、細胞分化和物質代謝，顯著地阻滯腦膜瘤的生長。因此，HIF-3α4在腦膜瘤中發揮重要的作用，是潛在的治療腦膜瘤的潛在分子靶點［21］。

9 總結

HIF是細胞應對氧氣水平降低時的主要調節因子，HIF-1α、HIF-2α和HIF-3α是HIF的3種活性亞基。近年來，對前兩種活性亞基，特別是HIF-1α進行了大量的研究工作，對這兩個亞基的基因分布及表達調控機制、激活和降解機制以及參與生理活動的機制都有深入的了解，相比前兩個亞基而言，對HIF-3α的研究和認識還比較有限。通過最近幾年的研究表明，人體的HIF-3α具有6種剪切變異體，每一種的結構都不一樣，其發揮的功能也可能不一樣。值得注意的是，hHIF-3α4是負調控因子，對HIF信號通路系統起負調控作用，使其與其他亞基相比具有獨特性。研究還提示，HIF-3α呈現出功能的多樣性，除了參與低氧應激的反應外，還參加了體內的其他生理過程，這也是與HIF-1α和HIF-2α不同的。例如HIF-3α參與組織和器官的分化和發育，以及糖代謝的過程等。由目前的實驗結果，我們認識到HIF-3α的功能是復雜的，具有獨特性。因此，深入研究HIF-3α的功能及其作用機制是及其必要的，將會為腫瘤和高原疾病的治療提供新的思路和策略。

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