穿膜肽引導核酸靶向性進入神經細胞的研究

高飛燕，張苗苗，徐興然，吳 靜，張恩齊，付愛玲

（西南大學藥學院，重慶 400716）

血 －腦屏障（blood-brain barrier，BBB）能夠阻擋幾乎所有的大分子和超過98%的小分子藥物的入腦轉運，從而阻礙了中樞神經系統（central nervous system，CNS）疾病的治療［1－2］。隨著 CNS疾病發病率的不斷增加，腦靶向給藥系統正日益受到重視，尋找克服BBB或促進藥物透過BBB并使之在腦內能達到有效濃度，已成為腦部疾病治療的發展目標［3］。目前，基因治療 CNS疾病具有廣闊的研究、應用和開發前景。為了能夠通透BBB，常規的基因治療手段是通過立體定位手術將基因載體直接輸送至腦內，這種手段存在較大弊端：擴散范圍小、藥物維持時間短、表達效率低，且不利于在人體上應用［4－5］。

基因治療的關鍵在于所使用的載體。基因治療的載體通常包括病毒［6］和非病毒載體，與病毒載體相比，非病毒載體具有明顯優勢。多肽作為一種非病毒載體，具有生物可降解性、生物相容性、低毒性、易于合成等優點，避免了使用病毒載體等傳統方法的毒性和免疫原性，在治療CNS疾病中展現出了良好的應用前景。目前已有文獻報道利用一些富含精氨酸的多肽［7－9］，如（RXRRBR）2XB和 PPTG，在體內成功介導了DNA、反義寡核苷酸或siRNA進入細胞并發揮作用。

我們實驗組前期的研究表明，來源于狂犬病毒糖蛋白的一個新型衍生肽（RVG-derived peptide，RDP），可以攜帶外源蛋白質特異性的進入中樞神經細胞。我們通過基因工程技術制備出RDP-β-Gal融合蛋白，小鼠尾靜脈注射該融合蛋白后，各組織切片結果顯示，該融合蛋白分布于整個腦部，而在外周組織幾乎沒有分布［10］。由此，本研究對RDP作為載體介導DNA進入神經細胞的可行性進行探究。以增強型綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）作為報告基因，用RDP包裹報告基因pEGFP，通過體外細胞轉染實驗以及體內動物實驗來檢測細胞、小鼠組織切片中報告基因產生的蛋白，探究RDP引導的DNA的靶向性及在體內、體外的表達情況。

1 材料與方法

1.1 試劑 RDP由上海強耀生物有限公司合成（純度＞99%）。pEGFP-N1質粒為本實驗室保存。DMEM培養基、F-12培養基和胎牛血清均購自Hyclone公司。DNA轉染試劑 Poly-Fecter購于北京唯尚立德生物有限公司。胰酶購于北京鼎國生物技術有限責任公司，神經母細胞瘤細胞（SH-SY5Y）為軍事醫學科學院毒物藥物研究所饋贈；中國倉鼠卵巢細胞（Chinese hamster ovary，CHO）購于北京鼎國生物技術有限責任公司。其它試劑均為分析純。

1.2 實驗動物 SPF級的健康♂昆明種小鼠，體質量（20±2）g，由重慶醫科大學動物中心提供。小鼠飼養以3～4只分籠，恒溫恒濕，每天給予充足的水，自由飲食，12 h光照，12 h黑暗。

1.3 細胞培養 SH-SY5Y和CHO分別采用含10%胎牛血清的DMEM-H／F-12（1∶1）和DMEM-H培養液，在37℃，CO2體積分數為5%的培養箱中進行常規培養。

1．4 質粒p EGFP-N1制備及濃度測定 用去內毒素質粒提取盒提取質粒pEGFP，ddH2O稀釋一定倍數后，紫外分光光度計分別測定DNA稀釋液在260 nm及280 nm的吸收值。記錄OD值，通過公式dsDNA＝50×（OD260）×稀釋倍數計算確定DNA濃度和純度，以上濃度單位以mg·L－1表示。

1．5 多肽-DNA復合物的凝膠電泳阻滯測定 根據不同的質量比在室溫下將pEGFP-N1和RDP混合，靜置30 min，用0.8 mg·L－1瓊脂糖凝膠電泳檢測，探究包裹的最佳比例。DNA以 EB標記，電泳緩沖液為1×TAE，在電壓為60 V的條件下電泳25 min，用Bio-Rad凝膠成像儀觀察。

1.6 圓二色譜分析 利用圓二色譜來研究RDP與DNA相互作用后構象的變化，并對凝膠電泳檢測出的最佳包裹比例進行確認。

1.7 體外細胞轉染 轉染前24 h，在96孔培養板內接種SH-SY5Y和CHO細胞，當孔內細胞生長達到60%～70%融合時開始轉染。用PBS沖洗細胞2次，每孔中加入0.1 ml無血清、無抗生素的培養基。再取該適量培養基，稀釋實驗組（RDP／pEGFP）、對照組（轉染試劑／pEGFP）和空白組（pEGFP）復合物至pEGFP濃度為0.2 mg·L－1，加入培養孔中，每組設3個平行孔。37℃，5%CO2培養箱中培養5 h后，移去介質，用PBS沖洗細胞2次，加入含有10%胎牛血清的培養基培養12～24 h，觀察細胞瞬時表達。

1.8 動物體內組織檢測 將RDP和pEGFP用ddH2O稀釋后按最佳比例混合，室溫靜置30 min。將小鼠隨機分為實驗組（12只，每只注射0.6 ml RDP／pDNA包裹物），對照組（12只，每只注射等量生理鹽水），在 d 1、d 3、d 5、d 7頸椎脫臼處死小鼠，取其腦、肝、腎等組織，迅速放置于－70℃冰箱，用OCT樹脂包埋，快速冷凍，用冷凍切片機切片（厚40 μm），在熒光顯微鏡下（Olympus：IX-70）以藍色波長范圍的光線激發，觀察EGFP熒光強度。

2 結果

2．1 RDP包裹EGFP-N1質粒的凝膠阻滯電泳檢測 Fig 1結果顯示，不同質量比條件下RDP與DNA的結合程度不同。DNA在加入較少的RDP（即R／E＜2∶1）時，部分 DNA未能被陽離子載體完全包覆而向陽極做定向遷移。隨著RDP的量不斷增大，當R／E≥2∶1時，質粒與多肽結合的非常緊密，復合物未發生遷移，DNA全部被RDP完全包覆而滯留在點樣孔內，達到了對DNA的阻滯作用。因此可得實驗中第5孔的比例為包裹的最佳比例，即RDP和EGFP-N1混合的最佳比例為2∶1。

Fig 1 Gel retardation assay．

2.2 圓二色譜檢測 圓二色譜儀于室溫下測量RDP以及包裹了DNA后的二級結構。RDP包裹了pEGFP后β-折疊由35.2增至54.4，轉角由14.9減至2.3。

Fig 2 CD spectra of RDP with or without the plasmid DNA．

2.3 細胞轉染 質粒pEGFP轉染細胞12～48 h后觀察熒光表達。Fig 3結果顯示，穿膜肽RDP可以攜帶DNA進入SH-SY5Y中，并表達綠色熒光蛋白，而在CHO中未檢測到熒光。此外，復合物 RDP／pEGFP轉染SH-SY5Y細胞后，于不同時間點觀察熒光表達。結果顯示（Fig 4），基因轉染12 h后，即能夠觀測到蛋白表達，隨著時間的延長，熒光逐漸增加，表明目的蛋白在細胞中不斷積累，而空白對照孔（僅加入pEGFP）未檢測到熒光。

Fig 3 Complex of RDP／pDNA is transfected into the SH-SY5Y and CHO cells for examination of specific protein expression（×200）A：CHO；B：SH-SY5Y

2．4 小鼠組織切片檢測EGFP基因在體內的表達

復合物RDP／pEGFP經尾靜脈給予小鼠后，分別在d 1、d 3、d 5、d 7觀察綠色熒光的分布。從組織的熒光強弱來看，腦組織的熒光最強，腎和肝次之。

3 討論

本研究中，瓊脂糖凝膠電泳阻滯實驗是用來探索多肽包裹核酸最佳比例的方法，我們驗證了RDP與DNA的最佳包裹比例是2∶1（W／W）。圓二色譜圖顯示出多肽RDP結合DNA后構象發生轉變，由35.2增至54.4，說明多肽結構呈β-折疊構象。由于RDP是pI值為12.3的堿性多肽，與帶負電荷的DNA可能通過正負電荷之間的靜電作用而結合。

Fig 4 Complex of RDP／p DNA is transfected into the SH-SY5Y cell for fluorescence analysis of specific protein expression at different times（×200）

Fig 5 Fluorescence expression detected in mouse tissue sections

在體外實驗中，RDP包裹的DNA能特異地進入SH-SY5Y細胞，且隨著轉染時間的增加熒光增強，而與之相同試驗條件下的非神經細胞CHO細胞沒有熒光顯示。在體內實驗中，可觀測到小鼠各組織切片中腦組織切片熒光信號最強，且持續大約1周時間。這些結果說明，RDP作為一種新型穿膜肽，能夠引導DNA靶向性進入神經細胞，在體內、體外均可表達目的蛋白，且不影響生物大分子的活性。

使用多肽作為基因治療載體具有廣闊的應用前景。一些穿膜肽，例如TAT、轉運素、多聚Arg等能夠在體外將核酸轉導入培養的細胞中，然而在體內，由于血清等其它因素的影響，絕大多數多肽不能有效引導核酸進入細胞，需要聯合其它非病毒載體（納米粒子、脂質體）才能實現核酸的體內轉運。在報道的文獻中，僅有MPG和Pep-1可單獨作為體內基因轉移的載體，但它們多集中在外周，在腦內的濃度較低［11］。本實驗中，我們使用的多肽RDP，能讓復合物進入體內神經細胞，高效地表達外源基因，實現了DNA的入神經細胞轉運。

RDP介導核酸入腦的機制目前尚不明確。已知RVG進入細胞是因為它能夠特異性地和神經細胞的煙堿型乙膽堿受體（nAChR）結合，從而使得病毒可以進入細胞，有文獻報道RVG29-d9R可通過nAChR的α7亞型受體介導siRNA進行胞吞作用轉運［12－13］。RDP來源于 RVG，因此推測其特異性受體也為nAChR。然而，RDP引導蛋白質進入神經細胞的機制研究表明，RDP及其融合蛋白可能是通過γ-氨基丁酸（GABA）受體介導的內吞通路進入神經細胞。已知血腦屏障和神經細胞膜表面存在著特異性的GABA受體，而GABA的A型受體 （GABAA）與nAChR同屬于配體門控的離子通道家族，配體進入細胞均依賴網格蛋白介導的內吞作用。此外，GABA和氯丙嗪（網格蛋白介導的內吞作用抑制劑）可以抑制細胞對RDP的特異性攝取，說明來源于RVG的RDP可以與GABA受體相互作用，通過網格蛋白介導的內吞作用進入細胞［14］。

總之，本研究表明RDP可能是一個有效的體內外神經細胞的基因表達載體。作為基因治療的一種合適的靶向神經細胞的載體，RDP在未來的非病毒載體應用中可能具有較大的潛力。

參考文獻：

［1］Pardridge W M.Biopharmaceutical drug targeting to the brain［J］.J Drug Target，2010，18（3）：157－67.

［2］周 宓，王志強.跨血腦屏障藥物轉運的研究進展［J］.生命科學研究，2009，13（4）：370－6.

［2］Zhou M，Wang Z Q.Advances in drug delivery across the bloodbrain barrier［J］.Life Sci Res，2009，13（4）：370－6.

［3］Brasnjevic I，Steinbusch H W，Schmitz C，et al.Delivery of peptide and protein drugs over the blood-brain barrier［J］.Prog Neurobiol，2009，87（4）：212－51.

［4］Fu A L，Yan X B，Sui L.Down-regulation of beta1-adrenoceptors gene expression by short interfering RNA impairs the memory retrieval in the basolateral amygdala of rats［J］.Neurosci Lett，2007，428（2－3）：77－81.

［5］Schlachetzki F，Zhang Y，Boado R，et al.Gene therapy of the brain：the trans-vascular approach［J］.Neurology，2004，62（8）：1275－81.

［6］張 陽，張志堅，俞曉嵐，等.慢病毒介導的新型90CE8A系統大鼠YU14和9P雙基因腦內轉移對帕金森病大鼠模型的保護作用［J］.中國藥理學通報，2011，27（2）：234－9.

［6］Zhang Y，Zhang Z J，Yu X L，et al.Protective effects of the intracerebal transfer of the lentiviral-mediated GDNF and TH bi-gene on the basis of improved Tet-on system in a rat model of Parkinson’s disease［J］.Chin Pharmacol Bull，2011，27（2）：234－9.

［7］Rittner K，Benavente A，Bompard-Sorlet A，et al.New basic membrane-destabilizing peptides for plasmid-based gene delivery in vitro and in vivo［J］.Mol Ther，2002，5（2）：104－14.

［8］Du L，Kayali R，Bertoni C，et al.Arginine-rich cell-penetrating peptide dramatically enhances AMO-mediated ATM aberrant splicing correction and enables delivery to brain and cerebellum［J］.Hum Mol Genet，2011，20（16）：3151－60.

［9］Meade B R，Dowdy SF.Exogenous siRNA delivery using peptide transduction domains／cell penetrating peptides［J］.Adv Drug Deliv Rev，2007，59（2－3）：134－40.

［10］Xiang L X，Zhou R M，Fu A L，et al.Targeted delivery of large fusion protein into hippocampal neurons by systemic administration［J］.J Drug Target，2011，19（8）：632－6.

［11］Deshayes S，Morris M，Heitz F，et al.Delivery of proteins and nucleic acids using a non-covalent peptide-based strategy［J］.Adv Drug Deliv Rev，2008，60（4－5）：537－47.

［12］Kumar P，Wu H，McBride J L，et al.Transvascular delivery of small interfering RNA to the central nervous system［J］.Nature，2007，448（7149）：39－43.

［13］Hwang do W，Son S，Jang J，et al.A brain-targeted rabies virus glycoprotein-disulfide linked PEI nanocarrier for delivery of neurogenic microRNA［J］.Biomaterials，2011，32（21）：4968－75.

［14］Fu A L，Zhao Z Z，Gao F Y，et al.Cellular uptake mechanism and therapeutic utility of a novel peptide in targeted-delivery of proteins into neuronal cells［J］.Pharm Res，2013，30（8）：2108－17.