蛋白酶體抑制劑YSY01A不依賴NF-κB通路抑制乳腺癌細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)凋亡研究

張 梅，袁 霞，徐 波，冉福香，吳 軍，葛澤梅，李潤濤，崔景榮

（北京大學(xué)藥學(xué)院1.天然藥物及仿生藥物國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、2.化學(xué)生物學(xué)系，北京 100191；3.新疆石河子大學(xué)藥學(xué)院藥理系，新疆石河子 832000）

PS341（硼替佐米，萬珂）于2003年被美國FDA批準(zhǔn)用于多發(fā)性骨髓瘤和淋巴瘤的治療［1］，該蛋白酶體抑制劑通過抑制蛋白酶體中的 CT-L（β5／β5i）、PGPH（β1／β1i）和 T-L（β2i）位點(diǎn)［2］引起細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡而產(chǎn)生抗腫瘤作用［3］，但同時也引起神經(jīng)疾病等不良反應(yīng)和耐藥性［4］。基于PS341結(jié)構(gòu)的啟發(fā)，李潤濤教授課題組合成了一系列新的三肽硼酸類化合物，經(jīng)過體內(nèi)外藥效學(xué)篩選發(fā)現(xiàn) YSY01A［N-（2-Pyrazinecarbonyl）-L-leucine-L-（2-naphthyl）-alanine-L-leucine boronic acid］（Fig 1）具有很強(qiáng)的殺傷腫瘤細(xì)胞及抗乳腺癌的作用。本文研究了YSY01A對乳腺癌增殖的影響，并以MCF-7細(xì)胞株為研究對象，探討了YSY01A的抗癌機(jī)制和蛋白酶體靶向作用。

Fig 1 Structure of YSY01A

1 材料與方法

1.1 材料 YSY01A和PS341由北京大學(xué)藥學(xué)院合成，純度均在99%以上。溶于DMSO中，配制成1×10－2mol·L－1濃度，－20℃凍存。Suc-LLVYAMC、Boc-LRR-AMC、Z-LLE-AMC、Z-RR-AMC和Me4BodipyFL-Ahx3Leu3VS均為 Boston Biochem公司。多克隆抗 體 ubiquitin、NF-κB，IκBα，XIAP、Bax、puma、endonuclease G和單克隆抗體 PARP、BclxL、GAPDH為 CST公司。Phospho-IκBα（P-IκBα）為Santa Cruz公司。野生型p53（wt-p53）為Bioss公司。Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒、JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒購自碧云天生物研究所。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人乳腺癌細(xì)胞 MCF-7、Bcap37、MDA-MB-435S細(xì)胞株購自中科院上海生命科學(xué)院細(xì)胞資源中心。MCF-7和MDA-MB-435S用含10%的血清和1%的雙抗 DMEM培養(yǎng)液在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，而 Bcap37細(xì)胞則用 RPMI 1640培養(yǎng)液。

1．3 26S蛋白酶體提取 收集MCF-7細(xì)胞，PBS洗滌2次，用裂解液（50 mmol·L－1Tris-HCl，pH 7.5，1 mmol·L－1DTT，5 mmol·L－1MgCl2，250 mmol·L－1蔗糖，2 mmol·L－1ATP）冰上裂解細(xì)胞30 min，低溫（4℃）10 000 r·min－1離心 15 min后，將上清4℃，15 000 r·min－1離心 1 h，去沉淀，用 Bradford法測定蛋白含量。

1．4 26S蛋白酶體的活性檢測 蛋白酶體活性常用熒光底物法檢測。Suc-LLVY-AMC、Boc-LRRAMC、Z-LLE-AMC分別為CT-L、T-L、PGPH的特異性熒光底物。體外活性檢測時，從MCF-7細(xì)胞內(nèi)提取26S蛋白酶體，不同濃度的YSY01A（或PS341）、26S蛋白酶體（12.5μg）和 50μmol·L－1的特異性熒光底物在緩沖液（50 mmol·L－1Tris-HCl，pH 7.5，5 mmol·L－1MgCl2，0.5 mmol·L－1ATP，1 mmol·L－1DTT，0.5 g·L－1BSA）中 37℃孵育 1 h。用多功能酶標(biāo)儀檢測 （λex＝390 nm，λem ＝440 nm）。檢測體內(nèi)活性時，用 37.5 nmol·L－1的YSY01A處理細(xì)胞1、2、4 h后，提取26S蛋白酶體。按照上述檢測蛋白酶活性的方法檢測熒光強(qiáng)度。

1.5 蛋白酶體活性譜分析 按照文獻(xiàn)［5－6］報(bào)道檢測細(xì)胞內(nèi)蛋白酶體活性譜。25 nmol·L－1的YSY01A作用于 MCF-7細(xì)胞1、2、4、8、12、24 h。PBS洗滌細(xì)胞2次，收集細(xì)胞后，按照“1.3”提取細(xì)胞內(nèi)26S蛋白酶體并定量。在競爭試驗(yàn)中，將26S與Me4BodipyFL-Ahx3Leu3VS（選擇性蛋白酶體熒光探針）（5μmol·L－1）在 37℃共孵育 1 h，蛋白變性后，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)12.5%SDS-PAGE分離β催化亞基。在凝膠成像儀上觀察膠內(nèi)帶熒光蛋白條帶。

1.6 蛋白免疫印跡分析 MCF-7細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)，用25 nmol·L－1的YSY01A分別處理細(xì)胞6、12、18、24、36 h，用 PBS洗滌細(xì)胞2次，收集細(xì)胞后，用全蛋白裂解液4℃裂解細(xì)胞，12 000 r·min－1離心，取上清，BCA法測定蛋白含量，加入雙蒸水和loading buffer配制成相同濃度的蛋白樣品，100℃煮沸5 min變性。－80℃儲存。等量的蛋白樣品進(jìn)行質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%SDS-PAGE分離，將蛋白轉(zhuǎn)移到NC膜上，封閉1 h，一抗（ubiquitin、PARP、NF-κB、IκBα、P-IκBα、Bax、Bcl-xL、XIAP、wt-p53、puma、endonuclease G、GAPDH）4℃孵育過夜。TBST漂洗，二抗（1∶10 000）孵育 1 h，TBST漂洗，用 ECL染膜 1 min，暗室中曝光于X膠片上。

1.7 細(xì)胞增殖測定 1×104個MCF-7細(xì)胞接種于96孔板小孔內(nèi)，YSY01A和 PS341（12.5、25、50、75、100、200 nmol·L－1）分別處理細(xì)胞 48 h。另外接種相同數(shù)量的細(xì)胞于96孔板小孔內(nèi)，用YSY01A（12.5、25、50、75、100、200 nmol·L－1）處理腫瘤細(xì)胞（MCF-7或MDA-MB-435S或Bcap37細(xì)胞）48 h。采用SRB法檢測細(xì)胞存活。

1.8 細(xì)胞凋亡檢測 1×106個MCF-7細(xì)胞接種于大培養(yǎng)瓶內(nèi)，用150 nmol·L－1的YSY01A處理細(xì)胞8、12、24 h后，PBS洗滌細(xì)胞，收集細(xì)胞。用 Blocking buffer懸浮細(xì)胞，AnnexinV-FITC與細(xì)胞室溫共孵育15 min，流式細(xì)胞儀檢測前5 min加入PI，然后檢測細(xì)胞狀態(tài)。

1．9 線粒體膜電位（MMP）測定 1×106個MCF-7細(xì)胞接種于大培養(yǎng)瓶內(nèi)，用 YSY01A（12.5、25、50、75、100、200 nmol·L－1）處理細(xì)胞8 h，用無血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞，并收集細(xì)胞。10 mmol·L－1的JC-1（用無血清培養(yǎng)基作為稀釋液）與細(xì)胞在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育30 min，PBS漂洗后，流式細(xì)胞儀檢測。1.10 數(shù)據(jù)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用ˉx±s表示，用SAS軟件處理數(shù)據(jù)，方差分析考察統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

Fig 2 Inhibitory effects of YSY01A on proteasome activity

2 結(jié)果

2.1 蛋白酶體抑制作用 細(xì)胞外蛋白酶體活性結(jié)果（Fig 2A）可看出YSY01A抑制CT-L、T-L和PGPH的活性，且對CT-L活性的抑制作用最強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)測得的YSY01A對 CT-L、T-L和 PGPH的 IC50值分別為（138.77±7.28）、（1328.94±146.02）、（716.39±72.31）nmol·L－1，其中 YSY01A抑制 T-L的作用比PS341強(qiáng)4倍，而對另外兩個催化位點(diǎn)的作用，YSY01A弱1～2倍。且YSY01A抑制MCF-7細(xì)胞內(nèi)的蛋白酶體活性（Fig 2B），其抑制特點(diǎn)同細(xì)胞外結(jié)果一致。通過分析蛋白酶體活性譜（Fig 2C），發(fā)現(xiàn) YSY01A能與 β5／β5i（CT-L活性）、β2／β2i（T-L活性）、β1／β1i（PGPH活性）結(jié)合，其結(jié)合能力和抑制作用一致。蛋白免疫印跡結(jié)果顯示（Fig 2D），YSY01A能使細(xì)胞內(nèi)泛素蛋白表達(dá)增加，表明該化合物抑制了蛋白酶體后使得泛素蛋白降解減少，從而出現(xiàn)堆積。這些結(jié)果都證實(shí)YSY01A是蛋白酶體抑制劑。

2.2 腫瘤細(xì)胞增殖抑制作用 雖然YSY01A是PS341同類物，但由于對蛋白酶體催化亞基選擇性不同，所以該化合物的抗腫瘤活性被檢測。12.5～200 nmol·L－1的 YSY01A和PS341均有明顯抑制MCF-7細(xì)胞增殖作用（Fig 3A），而且它們抑制細(xì)胞的 IC50分別為（42.5±4.5）和（57.1±0.8）nmol·L－1。另外YSY01A也不同程度地抑制另外兩種乳腺癌細(xì)胞增殖（Fig 3B），其對 MDA-MB-435S和Bcap37細(xì)胞的 IC50分別為（71.5±5.2）、（878.6±18.2）nmol·L－1。由結(jié)果可知，MCF-7細(xì)胞不僅對YSY01A最敏感，而且在小于100 nmol·L－1時比對PS341敏感性強(qiáng)。

Fig 3 Proliferative inhibitory effects of YSY01A on cancer cells

2.3 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡 YSY01A（150 nmol·L－1）作用MCF-7細(xì)胞8、12、24 h后，均出現(xiàn)細(xì)胞凋亡（Fig 4A）。結(jié)果顯示，YSY01A能引起細(xì)胞早期和晚期凋亡，細(xì)胞凋亡率分別為14.83%±1.30%、18.49%±2.71%、27.59%±1.39%，與對照組比較，差異均有顯著性（P＜0.05）。50 nmol·L－1的 YSY01A作用細(xì)胞12 h時（Fig 4B），全長PARP蛋白表達(dá)減少，而斷裂的PARP部分增加，表明細(xì)胞出現(xiàn)凋亡，且隨時間延長，細(xì)胞凋亡明顯增加。

2．4 NF-κB通路 大多數(shù)蛋白酶體抑制劑的抗腫瘤作用都與NF-κB通路有密切關(guān)系。YSY01A具有抑制蛋白酶體的活性，考察了YSY01A對NF-κB系統(tǒng)的影響，結(jié)果如圖（Fig 4C），50 nmol·L－1的YSY01A作用細(xì)胞2～24 h，P-IκBα呈現(xiàn)明顯的時間依賴性增加，而I-κBα則呈現(xiàn)時間依賴性減少，但細(xì)胞內(nèi)NF-κB沒有明顯變化。

Fig 4 Effects of YSY01A on apoptosis and NF-κB pathway

2.5 線粒體膜電位降低 線粒體是細(xì)胞凋亡的核心部位，不管是外源性還是內(nèi)源性的凋亡最終都經(jīng)線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，因此YSY01A對線粒體膜電位的影響首先被檢測（Fig 5A）。結(jié)果顯示，12.5～200 nmol·L－1的 YSY01A能使 MCF-7細(xì)胞內(nèi)JC-1單體增加，表明線粒體膜電位下降；與對照組相比，膜電位下降的細(xì)胞數(shù)增加了7.5% ～22.5%，而且呈濃度依賴性。檢測了線粒體相關(guān)蛋白的表達(dá)（Fig 5B），結(jié)果顯示，隨著YSY01A濃度的升高，MCF-7細(xì)胞內(nèi)的Bax蛋白表達(dá)增加，Bcl-xL蛋白表達(dá)減少，而兩者的比值明顯增大。凋亡抑制分子XIAP表達(dá)沒有明顯變化，但wt-p53和其調(diào)節(jié)的puma蛋白表達(dá)明顯增加。

Fig 5 Effects of YSY01A on mitochondrial pathway

3 討論

蛋白酶體抑制劑已經(jīng)成為重要的抗腫瘤藥。雖然PS341抗瘤譜廣，抑制腫瘤生長作用強(qiáng)，但因其嚴(yán)重的不良反應(yīng)使得該藥物在腫瘤治療方面受到限制。因此發(fā)現(xiàn)新蛋白酶體抑制劑成為抗腫瘤研究熱點(diǎn)之一。

本研究選用3種乳腺癌細(xì)胞，通過考察YSY01A對細(xì)胞增殖抑制的作用，發(fā)現(xiàn)該化合物在納摩水平就能明顯抑制MCF-7細(xì)胞的增殖。因此本研究以MCF-7細(xì)胞為模型，研究了YSY01A的抗癌機(jī)制及對蛋白酶體活性的影響。研究結(jié)果表明YSY01A能抑制MCF-7細(xì)胞中蛋白酶體的3個催化亞基，而且對CT-L的抑制作用最強(qiáng)，其次是PGPH，雖然對T-L的作用較弱，但比PS341作用強(qiáng)4倍。通過蛋白酶體活性譜的研究，發(fā)現(xiàn)YSY01A能與β5、β5i、β1、β1i、β2和 β2i活性位點(diǎn)結(jié)合，而 PS341則阻礙 β5、β5i、β1、β1i和 β2i位點(diǎn)［2］。這些結(jié)果證明YSY01A對蛋白酶體的選擇性與PS341不同。

蛋白酶體抑制劑的細(xì)胞毒性與抑制CT-L、T-L、PGPH活性有密切關(guān)系。一般蛋白酶體抑制劑抑制CT-L和T-L或PGPH就具有很強(qiáng)細(xì)胞毒作用，但如果3個活性位點(diǎn)都被抑制，使化合物的活性會進(jìn)一步增加［7］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證明了這一點(diǎn)，YSY01A抑制MCF-7細(xì)胞增殖的作用比PS341的作用強(qiáng)；在MCF-7、Bcap37和 MDA-MB-435S 3種乳腺癌細(xì)胞中，YSY01A的抑制MCF-7細(xì)胞增殖作用最強(qiáng)。

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞程序化死亡，主要包括外源性（死亡受體通路）和內(nèi)源性凋亡途徑（線粒體途徑）。本研究證實(shí)YSY01A是通過線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。除了經(jīng)典的凋亡途徑外，還有其他一些細(xì)胞因子會調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡。Puma是被p53調(diào)節(jié)的線粒體膜蛋白，促進(jìn)細(xì)胞色素C釋放［8］。XIAP凋亡抑制蛋白是IAP家族中最強(qiáng)的凋亡抑制因子。當(dāng)?shù)蛲霭l(fā)生時，線粒體膜孔開放，Cytochrome C、Endonuclearse G和AIF從線粒體中釋放到胞質(zhì)內(nèi)，Cytochrome C可以激活下游的Caspases蛋白，導(dǎo)致PARP斷裂，損傷DNA誘導(dǎo)凋亡。Endonuclearse G則轉(zhuǎn)入細(xì)胞核內(nèi)促發(fā)DNA片段化［9］。本研究結(jié)果表明YSY01A能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，通過抑制蛋白酶體活性，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的wt-p53增加，并進(jìn)一步激活線粒體膜上的puma蛋白，同時使Bcl-xL減少，而Bax增加，導(dǎo)致膜電位下降，膜孔開放，釋放 Endonuclearse G，而且PARP被激活，最終引起凋亡。

細(xì)胞凋亡是一個非常復(fù)雜的過程，也受很多通路的調(diào)節(jié)。有研究證實(shí)PS341通過NF-κB誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而且和自噬也有關(guān)系［10－12］。理論上講，YSY01A抑制蛋白酶體活性，造成P-IκBα的表達(dá)增加，應(yīng)該引起IκBα蛋白表達(dá)增加，但卻使其表達(dá)下降，這可能跟 IκBα其他調(diào)節(jié)途徑有關(guān)。然而YSY01A對乳腺癌細(xì)胞中NF-κB沒有影響，該結(jié)果表明YSY01A可能不從NF-κB蛋白水平調(diào)節(jié)凋亡。另外，YSY01A是否激活死亡受體通路，是否引發(fā)自噬也需進(jìn)一步研究探討。

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