ABCA1、ACAT1 DNA甲基化在Hcy致THP-1單核源性泡沫細胞膽固醇流出中作用研究

楊安寧，王 磊，周龍霞，趙 麗，王艷華，蔡 欣，曹成建，楊 程，陳久凱，馬文斌，姜怡鄧

（寧夏醫科大學1.基礎醫學院、2.檢驗學院，寧夏銀川 750004）

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是以單核源性巨噬細胞大量吞噬脂質并堆積在血管內膜下形成泡沫細胞為特征的慢性疾?。?］。腺苷三磷酸結合盒轉運體 A1（ATP-binding cassette transporter A1，ABCA1）和?；o酶A膽固醇?；D移酶1（acylcoenzyme A：cholesterol acyltransferase-1，ACAT1）在此過程中扮演了重要角色。ABCA1介導細胞內磷脂和游離膽固醇轉運至載脂蛋白A-1，促進高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL）生成，啟動膽固醇逆向轉運，在機體清除脂質過程中發揮重要作用［2］。ACAT1是一種催化膽固醇和脂肪酰輔酶A合成膽固醇酯的酶，其可以降低游離膽固醇對細胞的毒性作用［3］。DNA甲基化作為表觀遺傳學的重要調控方式，在維持正常細胞功能、遺傳印記、胚胎發育、腫瘤形成以及 AS發生中起重要作用［4－5］。循證醫學證據表明，同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）是AS的重要獨立危險因子，在體內，Hcy可能通過甲硫氨酸循環影響基因甲基化水平參與疾病發生［6］。因此，本文從DNA甲基化修飾角度探討ABCA1和ACAT1在Hcy致THP-1單核源性泡沫細胞膽固醇流出中的作用及可能機制，為進一步認識泡沫細胞脂質轉運平衡提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑 倒置相差顯微鏡（Olympus公司，日本）；超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司，中國）；電泳儀（Bio-Rad，美國）；CO2培養箱（Heraeus，德國）；Epoch全波段酶標儀（BioTek，美國）；BS110S型精密天平（Sartorius，德國）；PCR儀（Bio-Rad，美國）；HyClone RPMI 1640培養基（Thermo）；胎牛血清（杭州四季青生物工程材料研究所）；Hcy（Sigma）；總膽固醇（TC）試劑盒和游離膽固醇（FC）試劑盒及油紅O染色試劑盒（南京建成生物工程研究所）；青、鏈霉素（碧云天生物技術研究所）；佛波酯（PMA，Promega）；基因組DNA提取試劑盒（北京天根生物技術有限公司）；DNA甲基化修飾試劑盒、DNA甲基化轉移酶（DNMTs）活性分析試劑盒（Epigentek，美國）；引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1．2 THP-1單核源性泡沫細胞培養與分組 復蘇THP-1單核細胞，加入含10%胎牛血清，1%雙抗的RPMI 1640培養基，置37℃、5%CO2培養箱傳代培養，以4×109·L－1個細胞接種于25 cm2培養瓶，加入終濃度為100 nmol·L－1PMA的低血清培養基，37℃、5%CO2培養48 h，觀察細胞貼壁狀態，確定THP-1單核細胞已分化為巨噬細胞。換用含終濃度50 mg·L－1ox-LDL的不同濃度Hcy的RPMI 1640培養基繼續培養48 h，觀察泡沫細胞形成，收集細胞用于后續實驗。實驗分組為 ① 對照組：0μmol·L－1Hcy泡沫細胞（單核細胞 ＋PMA＋ox-LDL）；②實驗組：不同濃度 Hcy（50、100、200、500μmol·L－1）和 100μmol·L－1Hcy＋30μmol·L－1葉酸 ＋30μmol·L－1維生素 B12（100＋F＋V）干預泡沫細胞，每組3瓶。

1．3 油紅O染色觀察泡沫細胞形成 小心倒去培養液，用PBS緩沖液漂洗泡沫細胞3遍，4%多聚甲醛固定10 min，60%乙醇浸泡1 min，油紅O染色12 min，60%異丙醇分色3 min，37℃蒸餾水洗15 min，蘇木素染色1 min，蒸餾水洗后待干，用水性封固劑封片觀察。

1．4 巢式降落式甲基化特異性PCR（nMS-PCR）檢測ABCA1和ACAT1 DNA甲基化改變并分析兩者比值變化 提取細胞DNA并用核酸分析儀檢測OD260／OD280值，分析DNA樣品純度和濃度。通過甲基化引物在線設計軟件 http：／／www.urogene.org／methprimer／設計引物，見Tab 1。經PCR擴增后，瓊脂糖凝膠電泳檢測甲基化和非甲基化程度。

Tab 1 Primer sequence used for nMS-PCR

1．5 ELISA-like檢測DNMTs活性 用細胞刮刀收集細胞，PBS洗滌3次，重懸于0.5 ml磷酸鈉緩沖液（pH＞7.4）中，超聲裂解細胞1 min，按照DNMTs活性分析試劑盒說明書操作，用比色法檢測泡沫細胞內DNMTs的吸光度值，進一步計算胞內DNMTs活性。

1.6 細胞內膽固醇含量分析 收集細胞，用超聲細胞破碎儀破碎并收集上清，按照試劑盒說明書，采用化學酶促－比色法通過酶標儀檢測細胞內總膽固醇含量（total cholesterol，TC）和游離膽固醇（free cholesterol，FC）含量，并計算：膽固醇酯（cholesterol ester，CE）含量（mmol·L－1）＝TC-FC。Lowry法測定總蛋白含量，計算膽固醇與細胞內總蛋白的比值，分析膽固醇相對含量。

1.7 統計學方法 結果用ˉx±s表示。兩樣本均數間比較用Student’s t檢驗，多樣本均數間比較用One-way ANOVA檢驗，組間的兩兩比較用Student-Newman-Keuls檢驗。

2 結果

2．1 THP-1單核源性泡沫細胞培養和鑒定 THP-1單核細胞經PMA刺激48 h后，細胞由懸浮變為貼壁狀態，形狀呈長梭形或不規則形并有偽足伸出，即單核細胞分化為巨噬細胞。再給予ox-LDL刺激48 h后，油紅O染色見細胞體積增大，胞內充滿大量紅色脂滴，呈泡沫樣改變，細胞核呈藍色，即單核源性泡沫細胞形成，見Fig 1。

Fig 1 THP-1 monocyte-derived foam cells by oil red O staining（200×）

2．2 Hcy對THP-1單核源性泡沫細胞內ABCA1和ACAT1 DNA甲基化的影響及比值MABCA1／ACAT1改變 不同濃度Hcy刺激泡沫細胞后，分析各組細胞中ABCA1和ACAT1 DNA甲基化水平，并計算DNA甲基化比值MABCA1／ACAT1的變化。結果顯示：與對照組比較，ABCA1 DNA甲基化程度在50、100、200、500μmol·L－1Hcy組分別增加了 38.28%、55.98%、47.12%、37.93%，給予100＋F＋V干預后，與100μmol·L－1Hcy組比較，ABCA1 DNA甲基化程度降低了28.34%；ACAT1 DNA甲基化程度以100μmol·L－1Hcy組低甲基化程度最明顯，較對照組降低了8.32%，但變化不如ABCA1明顯，給予100＋F＋V干預后，與100μmol·L－1Hcy組比較，ACAT1 DNA甲基化程度增加了14.95%；不同濃度Hcy誘導泡沫細胞形成過程中，與對照組比較，MABCA1／ACAT1分別增加了 31.37%、70.04%、43.29%、45.98%，而100＋F＋V組與100μmol·L－1Hcy組比較，MABCA1／ACAT1降低了 37.63%，見 Fig 2。

Fig 2 Changes of ABCA1 and ACAT1 DNA methylation levels

2．3 ELISA-like檢測DNMTs的活性 不同濃度Hcy使THP-1單核源性泡沫細胞DNMTs活性增加，以50μmol·L－1Hcy組活性最高，與對照組比較，差異有顯著性 （P＜0.01）；在 100μmol·L－1Hcy組，DNMTs活性與對照組比較也明顯增加（P＜0.05），見 Fig 3。

2.4 細胞內膽固醇含量分析 Hcy干預泡沫細胞后，胞內膽固醇明顯增加，實驗組與對照組比較，差異有顯著性（P＜0.05）；胞內膽固醇含量與Hcy濃度不呈量效關系，以100μmol·L－1Hcy組膽固醇含量增加最明顯（P＜0.01），這說明Hcy減少了泡沫細胞內膽固醇流出，見Fig 4。

Fig 3 Hcy affects DNMTs activites of THP-1 monocyte-derived foam cells

Fig 4 Levels of cholesterol in foam cells（ˉx±s）

3 討論

ABCA1可介導細胞內磷脂和游離膽固醇轉運至載脂蛋白A-1，從而促進高密度脂蛋白生成，啟動膽固醇逆向轉運過程，在機體清除多余脂質的過程中發揮重要作用［7］。ACAT1是一種催化膽固醇和脂肪酰輔酶A合成膽固醇酯的酶，在巨噬細胞及血管平滑肌細胞中，膽固醇作為極性脂分子，易滲入膜脂質雙分子層中，構成細胞膜，而剩余的膽固醇則在ACAT1的作用下生成膽固醇酯，由于膽固醇酯是高度非極性分子，主要以脂滴的形式儲存于胞質中，細胞中過高濃度的膽固醇可形成結晶對細胞產生毒性作用，ACAT1的基本作用被認為是減少過高的游離膽固醇對細胞的毒性作用［8］。

Hcy是一種含硫氨基酸，其作為甲硫氨酸代謝的中間產物，參與了甲硫氨酸循環的關鍵環節［9］。實驗結果表明，Hcy濃度升高引起DNMTs活性增加，這顯然不可能是Hcy引起基因組廣泛去甲基化的原因，而可能是細胞企圖扭轉基因組低甲基化的代償反應。由于DNMTs的主要功能與維持甲基化狀態有關，因此，它很可能是某些已經甲基化的CpG島保持甲基化狀態的關鍵因素，即DNMTs的上調很可能與Hcy在導致基因組DNA廣泛去甲基化的同時引起某些基因啟動子區的高甲基化有關，這可以造成某些特定基因的沉默［10］。本次研究結果顯示，在Hcy干預下，THP-1單核源性泡沫細胞ABCA1基因啟動子區DNA高甲基化也就是這個原因。這提示DNMTs活性的增加可能為對抗DNA去甲基化的一種代償反應。

然而，泡沫細胞ACAT1啟動子區DNA呈低甲基化改變，可能由于Hcy濃度增加，使S-腺苷同型半胱氨酸（S-adenosyl homocysteine，SAH）降解受阻，引起甲硫氨酸循環紊亂，關鍵酶功能失調所致，這又一次證實了Hcy引起基因組廣泛去甲基化的結論。ABCA1基因高甲基化和ACAT1基因低甲基化，共同促進了泡沫細胞的形成，但ACAT1 DNA低甲基化程度不如ABCA1 DNA高甲基化程度明顯，即DNA甲基化比值MABCA1／ACAT1增大，提示Hcy干預THP-1單核源性泡沫細胞后，膽固醇從細胞內流出明顯減少，而細胞內膽固醇酯合成明顯增多，引起泡沫細胞內脂滴聚集進一步增多。ABCA1和ACAT1啟動子區DNA甲基化改變與Hcy并不呈劑量依賴關系，且在葉酸和VitB12干預下有逆轉趨勢，多次重復試驗均提示這一效應并非偶然。綜上所述，Hcy可能影響了甲硫氨酸循環中DNMTs活性，導致AS相關基因DNA甲基化改變，進而引起泡沫細胞形成過程中膽固醇代謝紊亂，此可能成為Hcy致AS的重要機制之一，這為我們進一步認識AS發病機制提供新的實驗依據。

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