表沒食子兒茶素沒食子酸酯全乙酰化衍生物對柔紅霉素致小鼠心臟毒性的影響

李 麗，唐燕霞，歐冰凝，周煥第，陳潤麗，劉布鳴，梁 鋼

（1.廣西醫科大學藥學院，廣西南寧 530021；2.廣西中醫藥大學藥學院，廣西南寧 530001；3.廣西中藥質量標準研究重點實驗室，廣西 南寧 530022）

柔紅霉素（daunorubicin，DNR）是常用的蒽環類藥物之一，抗腫瘤活性廣泛。然而DNR具有心臟毒性，重者可致心力衰竭甚至死亡，使其臨床應用受到了限制［1］。表沒食子兒茶素沒食子酸酯［（－）－epigallocatechin-3-gallate，EGCG］是從茶葉中提取的一種茶多酚單體，在茶葉中含量高且生物活性較強。EGCG具有抗氧化、抗肝癌及抑制心肌細胞氧化損傷等廣泛的生物活性［2－4］。研究發現［5］，EGCG能有效抑制羰基還原酶（CBR1）的代謝活性，增強DNR抗腫瘤作用并降低其心臟毒性。但由于EGCG脂溶性差、體內不穩定以及生物利用度低等原因使其應用受到了限制。EGCG乙酰化衍生物是在EGCG的側鏈酚羥基上進行乙酰化修飾獲得的，其穩定性和生物利用度比EGCG高［6］。體外實驗表明EGCG全乙酰化衍生物（AcEGCG）有較好的逆轉肝癌多藥耐藥性作用［7］；AcEGCG聯合5-FU的體內抑瘤作用比 EGCG聯合5-FU的增強，且毒性降低［8］。本研究旨在通過制備柔紅霉素致小鼠心臟毒性模型，觀察AcEGCG對心電圖、心肌酶等生化指標及心肌超微結構的影響，探討AcEGCG對心臟毒性的保護作用及初步作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 昆明種小鼠80只，清潔級，♀♂各半，體質量（20±2）g，由廣西醫科大學實驗動物中心提供，合格證號：SCXK桂2009－0002。

1.1.2 藥物與試劑 柔紅霉素，Actavis Italy S.p.A.（批號 1F10111）。AcEGCG，純度 98.77%，本課題組自合成，臨用前用質量濃度為5 g·L－1的羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）溶液制成混懸液。丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）、乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒為上海執誠生物科技股份有限公司產品；肌酸激酶（CK）、肌酸激酶MB同工酶（CK-MB）、α-羥基丁酸脫氫酶（α-HBDH）試劑盒為德賽診斷系統（上海）有限公司產品。高敏肌鈣蛋白 T（TNT-Hs）檢測試劑盒為羅氏公司產品。SOD、MDA及蛋白測定試劑盒購自南京建成生物工程有限公司。

1.1.3 主要儀器 BL-420E生物機能實驗系統（成都泰盟科技有限公司）；7600-020 Automatic Analyzer（HITACHI）；羅氏 Cobas 6000；H-7650型透射電鏡（日本日立）。

1.2 方法

1.2.1 小鼠心臟毒性模型的制備及給藥方法 小鼠適應性喂養1周后，檢測心電圖，取正常者隨機分為4組（每組 20只）：①正常對照組（Control）；②DNR模型組（Model）；③AcEGCG高劑量組（HAcEGCG）；④AcEGCG低劑量組（L-AcEGCG）。參考AcEGCG體內抑瘤作用劑量［8］設計本實驗給藥劑量，按 0.02 ml·g－1的灌胃（ig）體積計，AcEGCG高劑量組80mg·kg－1·d－1，AcEGCG低劑量組 40 mg·kg－1· d－1，正常對照組和模型組 ig給予質量濃度為5 g·L－1的CMC-Na，連續給藥7 d。在末次ig給藥1 h后，除正常對照組腹腔注射（ip）等體積NS外，其余各組小鼠 ip DNR（15 mg·kg－1），制備DNR心臟毒性模型［9］。

1.2.2 心電圖觀察 注射DNR 48 h后，小鼠用3%水合氯醛腹腔注射麻醉，仰臥固定，采用標準肢體Ⅱ導聯描記心電圖，觀察心律失常的發生率。本實驗中，出現各種類型的期前收縮、房室傳導阻滯、竇性心動過速、竇性心動過緩等之一者為心律失常陽性［10］。

1.2.3 標本收集 描記心電圖后，小鼠摘眼球取血，制備血清。并立即處死動物，取出心臟，用預冷NS沖洗，濾紙吸干后稱重，在冰浴中取心室部分，用NS制成10%心肌組織勻漿，4℃，3 000 r·min－1離心10 min后，取上清液檢測生化指標。取心尖部米粒大小心肌用于電鏡觀察。

1.2.4 生化指標檢測 在全自動生化分析儀上測定血清心肌酶（ALT、AST、CK、CK-MB、LDH、α-HBDH）活性；采用化學發光法檢測血清TNT-Hs含量；采用考馬斯亮藍法測定心肌蛋白含量；采用試劑盒測定血清與心肌中SOD活性和MDA含量。

1.2.5 電鏡觀察 取心尖部米粒大小心肌，2.5%戊二醛和1%鋨酸雙重固定，丙酮脫水，樹脂包埋，超薄切片，1%醋酸雙氧鈾及枸櫞酸鉛雙重染色，透射電鏡觀察。

1.3 統計學處理 實驗數據以ˉx±s表示，用SPSS 13.0統計軟件進行統計，兩樣本均數比較采用t檢驗，兩組樣本率比較采用Fisher′s確切概率法。

2 結果

2．1 AcEGCG對小鼠心電圖和血清TNT-Hs水平的影響 注射DNR 48 h后，模型組小鼠的心律失常發生率明顯高于正常對照組（P＜0.01），AcEGCG給藥組與模型組比較，心律失常發生率有所降低，但無統計學意義（P＞0.05）。模型組小鼠血清TNTHs水平明顯高于正常對照組（P＜0.01）。與模型組比較，AcEGCG高、低劑量組小鼠血清TNT-Hs水平明顯降低（P＜0.01）（Tab 1）。

Tab 1 Effects of AcEGCG on electrocardiogram and levels of serum TNT-Hs in DNR-induced cardiotoxic mice

2．2 AcEGCG對小鼠血清心肌酶譜的影響 模型組小鼠血清心肌酶（ALT、AST、CK、CK-MB、LDH、α-HBDH）活性均明顯高于正常對照組（P＜0.01）。與模型組比較，AcEGCG高、低劑量組小鼠血清心肌酶活性明顯降低（P＜0.01，P＜0．05）（Tab 2）。

2．3 AcEGCG對小鼠血清和心肌SOD活性和MDA含量的影響 模型組小鼠血清和心肌SOD活性明顯低于正常對照組（P＜0.01），MDA含量明顯升高（P＜0.01，P＜0.05）。與模型組比較，AcEGCG高、低劑量組小鼠血清和心肌SOD活性明顯升高（P＜0.05），MDA含量降低（P＜0．01，P＜0.05）（Tab 3）。

2．4 AcEGCG對小鼠心肌超微結構的影響 與正常組（Fig 1A）相比，模型組（Fig 1B）心肌組織超微結構損傷明顯，心肌細胞腫脹，部分肌絲排列紊亂，出現斷裂溶解，線粒體腫脹明顯，線粒體嵴斷裂。AcEGCG低劑量組（Fig 1C）心肌纖維結構基本正常，線粒體輕度腫脹，可見少數肌絲斷裂，個別線粒體嵴斷裂，心肌損傷比模型組明顯減輕。

Tab 2 Effects of AcEGCG on serum myocardial enzymes in DNR-induced cardiotoxic mice（ˉx±s）

Tab 3 Effects of AcEGCG on activities of SOD and content of MDA in serum and myocardium in DNR-induced cardiotoxic mice（ˉx±s）

Fig 1 Effects of AcEGCG on myocardial ultrastructure in DNR-induced cardiotoxic mice

3 討論

DNR等蒽環類藥物主要通過插入DNA雙鏈、抑制拓撲異構酶Ⅱ和細胞凋亡作用殺死腫瘤細胞。除了高效抗腫瘤作用，DNR對正常健康細胞尤其是心肌細胞有毒性作用［11］。研究發現，DNR在體內被羰基還原酶1（CBR1）代謝為柔紅霉素醇，柔紅霉素醇不僅抗腫瘤活性比柔紅霉素低，還會造成心肌細胞損傷［12］。心肌細胞膜受損后，細胞內的多種酶外漏，如乳酸脫氫酶（LDH）、肌酸磷酸激酶（CK）等，嚴重影響細胞功能［13］。因此，血清心肌酶譜（ALT、AST、CK、CK-MB、LDH、α-HBDH）是臨床上反映心肌損害的主要生化指標。高敏肌鈣蛋白T（TNT-Hs）為心肌結構蛋白，是心肌細胞損傷的一個高敏性標志物，可檢出某些心肌酶譜不能檢出的微小損傷［14］。MDA作為膜脂質過氧化產物，其含量高低間接反映機體細胞受自由基攻擊的嚴重程度，而SOD活性高低反映機體清除氧自由基的能力。

本實驗給予小鼠腹腔注射 DNR（15 mg·kg－1），48 h后模型組小鼠心律失常發生率高達65%，血清心肌酶 ALT、AST、CK、CK-MB、LDH、α-HBDH水平升高，TNT-Hs釋放增多，血清和心肌SOD活性降低，MDA含量升高，心肌超微結構明顯損傷，DNR致小鼠心臟毒性模型復制成功。而預先給予AcEGCG的小鼠心律失常發生率有一定程度降低，但無統計學意義。AcEGCG還抑制血清心肌酶 ALT、AST、CK、CK-MB、LDH、α-HBDH活性，降低血清TNT-Hs水平，提高血清和心肌SOD活性，降低MDA含量。結果提示AcEGCG可以保護心肌細胞，拮抗DNR心臟毒性，其作用機制可能與提高心肌中抗氧化酶活性和清除自由基有關。電鏡下觀察，可見AcEGCG低劑量組心肌超微結構損傷減輕。AcEGCG作為EGCG的結構修飾衍生物，化學穩定性提高、脂溶性增強，生物利用度增加，進入體內可轉化為EGCG，通過抑制CBR1活性，減少DNR代謝生成柔紅霉素醇，從而降低其心臟毒性［5－6］。由此我們設想，AcEGCG有望代替EGCG，用于腫瘤的防治，與DNR聯用，可能既預防或減輕DNR對心肌的損傷，又協同或增強DNR的抗腫瘤作用。研究結果將為開發新一代腫瘤防治藥物提供新思路，也將為EGCG衍生物的研發提供實驗依據。

體內實驗表明［8］，AcEGCG 80 mg·kg－1單獨使用對腫瘤細胞殺傷力較弱，卻明顯增強5-FU的抗腫瘤作用，提示在發揮增效減毒作用時，AcEGCG所需劑量可能較小。因此，本實驗以80 mg·kg－1作為高劑量，40 mg·kg－1作為低劑量。結果顯示，AcEGCG高、低劑量組作用無明顯差異，且低劑量組總體上略好于高劑量組。原因可能為80 mg·kg－1超出AcEGCG降低心臟毒性作用的量效關系范圍，其增效減毒的最佳劑量還需進一步摸索。

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