新生霉素通過誘導(dǎo)DNA損傷抑制慢粒白血病細(xì)胞增殖

黃立森，陳顯凌，柯 方，許建文，鄭 鳴，許建華，吳麗賢

（1.福建醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥理系，福建 福州 350004；2.福建省天然藥物藥理學(xué)重點實驗室，福建福州 350004；3.福建醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥化系，福建福州 350108；4.福建醫(yī)科大學(xué)解剖系，福建 福州 350108；5.福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院血液科，福建福州 350001；6.福建省血液病研究所，福建福州，350001）

慢性粒細(xì)胞白血病（CML）［1］，是一種骨髓造血功能紊亂的克隆異常增生性疾病，以嵌合染色體BCR-ABL［2］陽性為主要特點，該基因產(chǎn)物為分子質(zhì)量210 ku的具有酪氨酸酶活性的p210蛋白。伊馬替尼（IM）是p210蛋白的競爭性抑制劑，能夠競爭抑制p210蛋白的酪氨酸酶活性，發(fā)揮抗CML的作用，對BCR-ABL陽性初始治療的慢性期CML患者療效明顯，隨著臨床的長期廣泛使用，暴露出越來越多的問題，其一、IM對急性期、急變期以及 BCR-ABL突變（如 T315I突變［3］）的 CML患者療效差；其二、IM耐藥案例不斷增加；因此探尋其它具有抗CML的藥物，研究新的作用機制和作用靶點，對于治療CML和解決CML的耐藥問題具有重要的意義。

損傷DNA是當(dāng)前臨床治療腫瘤常用的放射治療及絕大多數(shù)抗癌藥物共同的分子機制。雖然DNA損傷的分子機制不盡相同，但都可以通過6條修復(fù)通路予以修復(fù)。在DNA損傷中，雙鏈斷裂對腫瘤細(xì)胞是最致命的打擊，它的修復(fù)主要通過兩種機制實現(xiàn)：一種是同源重組（HR），使用姐妹染色體的同源序列重新合成 DNA，需要 Rad51、NBS1、BRCA1和BRCA2等參與，這些蛋白在DNA損傷處形成聚集點（foci）；另一種是非同源末端連接 （NHEJ），斷裂的DNA末端重新連接，可以在沒有模板的情況下進(jìn)行 DNA修復(fù)，但也更容易發(fā)生錯誤，主要依賴Ku70／80異二聚體與DNA依賴的蛋白激酶催化亞單位（DNA-PKcs）結(jié)合形成DNA-PK全酶，后者募集XRCC4和DNA連接酶Ⅳ完成NHEJ修復(fù)。DNA修復(fù)能力異常激活和增強是導(dǎo)致腫瘤對DNA損傷劑耐藥的重要分子基礎(chǔ)；相反，修復(fù)缺陷則使腫瘤對其高敏感。目前已有10余種靶向不同DNA修復(fù)分子的化合物正在進(jìn)行不同階段的臨床試驗。

新生霉素（novobiocin，Nov）是香豆素類抗生素的代表藥物，對DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ有很好的抑制作用［4］，對多種癌細(xì)胞有抑制作用，可以用于抗癌藥聯(lián)合應(yīng)用以及逆轉(zhuǎn)抗癌藥的耐藥性，還有研究表明Nov是熱休克蛋白 90（HSP90）的 C端抑制劑［5］，能夠抑制HSP90的分子伴侶功能，影響客戶蛋白的正確結(jié)構(gòu)和功能，間接發(fā)揮抗腫瘤作用。本文從DNA損傷的角度探尋Nov治療腫瘤的新機制，為更深入全面地研究Nov抗腫瘤機制以及開發(fā)更多活性更強的NOV衍生物奠定理論基礎(chǔ)。引起細(xì)胞DNA損傷的因素有很多，包括物理因素、化學(xué)因素和自身的代謝產(chǎn)物。在細(xì)胞正常生理活動時可以產(chǎn)生ROS，但是在藥物作用下ROS產(chǎn)生過多，對腫瘤細(xì)胞可產(chǎn)生毒性作用如DNA損傷，殺傷腫瘤細(xì)胞。因此，本實驗旨在探討Nov誘導(dǎo)DNA損傷的效應(yīng)是否通過產(chǎn)生大量ROS，為今后本課題組合成活性更高的、有DNA損傷作用的新型Nov衍生物提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 Nov購于美國Sigma公司，溶解于二甲基亞砜（DMSO）中，配成儲存液 400 mmol·L－1于－20℃?zhèn)溆茫褂们敖鈨觯门囵B(yǎng)液稀釋成所需濃度。IM購于Higher Biotech Co Ltd，溶解于DMSO中，配成儲存液10 mmol·L－1于－20℃?zhèn)溆茫褂们敖鈨觯门囵B(yǎng)液稀釋成所需濃度。Hyclone RPMl 1640培養(yǎng)基和Hyclone胎牛血清均購于Thermo Scientific Co Ltd。MTT（3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽）購置于美國Sigma公司，用磷酸鹽緩沖液（PBS）稀釋成5g·L－1存儲液，小劑量分裝 ，－20℃避光儲存。r-H2AX、p-ATM、p-CHK1、p-CHK2、Parp、p-p53、CDC25A、CDC25C、cleaved Caspase-3單克隆抗體均購置于Cell Signaling Technology公司，β-actin單克隆抗體和羊抗鼠、羊抗兔IgG-HRP二抗購于凱基生物公司。ECL Western blotting Detection System超強發(fā)光底物購置于Signalway Antibody公司。苯甲基磺酰氟（PMSF）、蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑、BCA蛋白定量試劑盒、流式凋亡檢測試劑盒均購自瑞士Roche公司，JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒購于凱基生物公司，CFSE、RNA酶和碘化丙啶（PI）購于美國Sigma公司，ROS檢測試劑盒購于碧云天公司。Image station 4000MM成像系統(tǒng)購于柯達(dá)公司；BD FACSCantoⅡ流式細(xì)胞儀購于BD公司，電泳、轉(zhuǎn)膜儀為BIORAD公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) K562細(xì)胞采用含0.1的胎牛血清 RPMI 1640，青霉素（1×105IU·L－1）和鏈霉素（50 mg·L－1），在 37℃、5%的 CO2孵育箱中培養(yǎng)，K562／G01細(xì)胞采用含10%的胎牛血清RPMI 1640，青霉素（1×105IU·L－1）和鏈霉素（50 mg·L－1）以及維持4μmol·L－1IM，在37℃、5%的 CO2孵育箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實驗。

1.2.2 MTT法研究Nov對K562和K562／G01細(xì)胞增殖的抑制作用 96孔培養(yǎng)板上每孔種植1×104個細(xì)胞，體積為200μl，實驗組分別加入不同濃度的Nov和IM，對照組不加藥，另設(shè)空白組（只加培養(yǎng)基，無細(xì)胞），每組設(shè)3個復(fù)孔，37℃培養(yǎng)48 h，每孔加入 5 g·L－1的 MTT溶液20μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，800×g離心5 min棄上清，加入DMSO 150μl，振蕩10 min，用全自動酶標(biāo)儀（Therm公司）檢測570 nm處的吸光度（OD）值，結(jié)果采用GraphPad Prism 5軟件分析，并繪制相應(yīng)的抑制率－對數(shù)濃度曲線，計算藥物的IC50。

1.2.3 CFSE檢測Nov對K562及K562／G01細(xì)胞增殖代數(shù)的影響［6］取對數(shù)生長期的 K562及K562／G01細(xì)胞，用 5μmol·L－1CFSE 37℃預(yù)先處理10 min，加入冰冷的含有0.1 FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液終止反應(yīng)并洗滌細(xì)胞2次，分組并加入不同濃度的Nov和IM處理72 h。收集細(xì)胞，PBS洗滌2次，上機檢測，結(jié)果采用Modfit軟件分析。

1.2.4 流式細(xì)胞技術(shù)檢測Nov對K562及K562／G01細(xì)胞ROS的影響 通過使用氧化敏感的熒光探針（DCFH-DA）檢測細(xì)胞內(nèi) ROS的水平［7］。不同濃度的Nov處理細(xì)胞24 h。收集細(xì)胞，用PBS洗滌2次，37℃下用10μmol·L－1的 DCFH-DA孵育細(xì)胞20 min（根據(jù)產(chǎn)品說明）。DCFH-DA被細(xì)胞內(nèi)的非特異性酯酶脫去乙酰基，被ROS氧化成熒光性化合物DCF，流式細(xì)胞儀檢測DCF熒光強度。

1.2.5 流式檢測 Nov對 K562和K562／G01細(xì)胞DNA損傷的影響 取對數(shù)生長期K562及K562／G01細(xì)胞，10μmol·L－1的 Brdu預(yù)處理 30 min，不同濃度的Nov和IM處理細(xì)胞24 h，收集細(xì)胞，以800 r·min－1離心5 min，棄上清，破膜，DNase處理1 h，anti-BrdU，anti-H2AX，anti-cleaved parp熒光探針室溫孵育20 min，按試劑盒說明操作。轉(zhuǎn)入到流式管中，上機檢測。

1.2.6 流式細(xì)胞儀檢測藥物對K562及K562／G01細(xì)胞線粒體膜電位［8］的影響 取對數(shù)生長期的K562和 K562／G01細(xì)胞，分組并加入不同濃度的Nov和IM處理4 h；收集細(xì)胞，800×g離心5 min；用冷PBS重懸洗滌細(xì)胞2次；按試劑盒說明進(jìn)行JC-1染色，37℃避光孵育20 min；流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.7 碘化丙啶染色法流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期

取對數(shù)生長期的K562及K562／G01細(xì)胞，分組并加入不同濃度的Nov和IM，37℃培養(yǎng)48 h；收集細(xì)胞，800 g離心5 min；用冷的 PBS重懸洗滌細(xì)胞1次，再用0.5 ml冷PBS重懸細(xì)胞，并將其緩慢的滴加4.5 ml預(yù)冷體積分?jǐn)?shù)為0.75乙醇中，－20℃冰箱中放置過夜；800×g離心5 min，棄去乙醇，用PBS洗滌1次，用0.5 ml含有50 mg·L－1RNA酶和50 mg·L－1碘化丙啶的PBS重懸細(xì)胞，室溫避光孵育30 min，流式細(xì)胞儀檢測。實驗結(jié)果采用Modifit軟件進(jìn)行分析。

1.2.8 流式細(xì)胞儀檢測藥物對K562及K562／G01細(xì)胞凋亡的影響 取對數(shù)生長期的K562和K562／G01細(xì)胞，不同濃度的Nov和IM處理48 h，收集細(xì)胞，800×g離心5 min，冷PBS重懸洗滌細(xì)胞2次，用500μl含有分別含有5μl Annxin V-FITC和5μl PI的Binding Buffer重懸混勻細(xì)胞，室溫避光孵育15 min，轉(zhuǎn)移入流式管中，流式細(xì)胞儀上機檢測。

1.2.9 蛋白免疫印跡法檢測藥物對K562和K562／G01細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 取對數(shù)生長期的K562和K562／G01細(xì)胞，不同濃度的 Nov處理48 h，收集裂解細(xì)胞，蛋白定量，98℃蛋白變性，SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜，封閉，相應(yīng)一抗過夜孵育，TBST洗滌3次，每次10 min，室溫下二抗孵育1 h，TBST洗滌3次，每次10 min，用 ECL Western blotting Detection System超強發(fā)光底物在Image station 4000MM成像系統(tǒng)進(jìn)行曝光顯影。

1.3 統(tǒng)計方法 實驗數(shù)據(jù)采用ˉx±s表示，實驗獨立重復(fù)3次，采用One-Way analysis of variance統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2．1 Nov可明顯抑制 K562和 K562／G01細(xì)胞的增殖 不同濃度的Nov和IM處理K562和K562／G01細(xì)胞48 h后，MTT法檢測，結(jié)果采用GraphPad Prism5軟件分析（Fig 1），可以明顯看出隨著藥物濃度的增加，Nov能明顯抑制K562和K562／G01細(xì)胞的增殖，IC50分別為（232.50±0.22）μmol·L－1和（237.10±0.13）μmol·L－1。

Fig 1 Proliferation inhibition of K562 and K562／G01 with Nov treatments

CFSE是一種能夠輕易穿透細(xì)胞膜并對細(xì)胞無毒性作用的熒光染料［9］。在細(xì)胞分裂增殖過程中，標(biāo)記熒光可平均分配至子代細(xì)胞中，熒光強度會隨著細(xì)胞的分裂而逐級遞減，因此可用于檢測細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期的估算及細(xì)胞分裂等情況。實驗結(jié)果表明Nov能減少K562和K562／G01細(xì)胞的增殖分裂代數(shù)，抑制細(xì)胞的增殖（Fig 2）。

Fig 2 Effect of Nov treatments on proliferation generations of K562 and K562／G01

2．2 Nov明顯增加 K562和 K562／G01細(xì)胞內(nèi)ROS水平，并誘導(dǎo)DNA的損傷 不同濃度的Nov和IM處理K562和K562／G01細(xì)胞24 h后，ROS檢測表明Nov能明顯增加K562及K562／G01細(xì)胞內(nèi)ROS的水平。ROS能夠氧化DCFH-DA成熒光性化合物DCF，因此檢測DCF的熒光強度可以間接反映ROS的水平。與對照組相比0.2、0.4μmol·L－1IM，150、300μmol·L－1Nov，5 mmol·L－1NAC，5 mmol·L－1NAC＋300μmol·L－1Nov處理 K562細(xì)胞24 h DCF增加的倍數(shù)分別為1.09±0.03（NS），1.23±0.02（P＜0.01），1.44±0.03（P＜0.01），1.67±0.04（P＜0.01），0.98±0.02（NS），1.09±0.02（NS）（P＜0.01，n＝3）；對于 K562／G01細(xì)胞，0.2、0.4μmol·L－1IM，150、300μmol·L－1Nov，5 mmol·L－1NAC，5 mmol·L－1NAC＋300μmol·L－1Nov處理24 h DCF增加的倍數(shù)分別為1.02±0.01（NS），1.06±0.02（NS），1.56±0.05（P＜0.01），1.71±0.03（P＜0.01），0.97±0.03（NS），1.01±0.01（NS）（Fig 3）。

Fig 3 Effect of Nov treatments on intracellular ROS（ˉx±s，n＝3）

r-H2AX是DNA損傷的一個靈敏性標(biāo)志物［10］，在DNA損傷時，其聚集在DNA損傷處，招募DNA損傷應(yīng)答的相關(guān)蛋白。Parp是DNA損傷修復(fù)的功能蛋白，當(dāng)其被切割成 cleaved-parp便失去修復(fù)DNA損傷的功能，從本實驗的結(jié)果可以看出Nov能明顯增加K562和K562／G01細(xì)胞中r-H2AX的表達(dá)和Parp的切割，而NAC預(yù)先處理1 h能逆轉(zhuǎn)Nov對r-H2AX和Parp的改變（Fig 4）。

2．3 Nov降低 K562和 K562／G01線粒體膜電位

不同濃度的Nov和IM處理K562和K562／G01細(xì)胞24 h，JC-1染色流式細(xì)胞術(shù)檢測線粒體膜電位的改變，結(jié)果表明隨著Nov藥物濃度的增加JC-1 Red／Green的比值隨之減小。5 mmol·L－1NAC預(yù)先處理細(xì)胞1 h能夠逆轉(zhuǎn)Nov誘導(dǎo)的線粒體膜電位的降低（Fig 5）。

2．4 Nov使K562和K562／G01細(xì)胞周期阻滯G2／M期和增加細(xì)胞的凋亡率 不同濃度的Nov和IM處理K562和K562／G01細(xì)胞48 h，PI染色流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期，結(jié)果表明隨著Nov藥物濃度的增加，G2／M期K562和K562／G01細(xì)胞比例明顯增加，而IM對細(xì)胞周期的影響較小（Fig 6）。

不同濃度的Nov和IM處理K562和K562／G01細(xì)胞48h，PI和Annexin V-FITC雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果表明，對于K562細(xì)胞，與對照組相比，0.2，0.4μmol·L－1IM，150，300μmol·L－1Nov，5 mmol·L－1NAC，5 mmol·L－1NAC＋300 μmol·L－1Nov誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡率分別為（9.70±0.57）%（P＜0.01），（18.50±0.60）%（P＜0.01），（9.30±0.98）%（P＜0.01），（30.40±0.93）%（P＜0.01），（3.867±0.93）% （NS），（7.467±0.41）%；對于K562／G01細(xì)胞，與對照組相比0.2、0.4μmol·L－1IM，150、300μmol·L－1Nov，5 mmol·L－1NAC，5 mmol·L－1NAC＋300μmol·L－1Nov誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡率分別為（13.27±1.31）%（NS），（12.23±1.56）%（NS），（29.63±0.58）%（P＜0.01），（42.77±1.45）%（P＜0.01），（10.27±1.27）%（NS），（11.43±1.49）%（NS），F(xiàn)ig 7。

2．5 Nov對 K562及 K562／G01蛋白表達(dá)的影響

不同濃度的Nov和IM處理K562和K562／G01細(xì)胞48 h，蛋白免疫印跡結(jié)果表明，Nov能明顯增加r-H2AX、p-ATM、p-CHK1、p-CHK2、p-p53、細(xì)胞色素 C的表達(dá)以及 Parp和 Caspase-3的切割，而降低CDC25A和CDC25C的表達(dá)（Fig 8）。

Fig 4 Nov induced DNA damage and inhibited the function of parp（ˉx±s，n＝3）

3 討論

新生霉素在抗腫瘤方面的研究并不很多，可能源于其抗腫瘤的活性較低，從本實驗的結(jié)果可以看出Nov雖然能夠抑制K562和K562／G01細(xì)胞的增殖，但I(xiàn)C50偏高，活性偏低，相對于CML治療的新型靶向藥物IM，IM抗CML活性是Nov的1 000倍，但Nov也具有其優(yōu)點：其一是毒性低、價格低廉；其二是Nov對K562和IM耐藥K562／G01細(xì)胞都具有相當(dāng)?shù)幕钚浴Ｒ虼搜芯縉ov的作用機制對于合成新的活性更高的衍生物提供了理論基礎(chǔ)，也為解決CML耐藥問題提供一個新的策略。ROS在DNA損傷過程中起到重要的作用［11］，它能夠攻擊細(xì)胞的重要結(jié)構(gòu)，如細(xì)胞膜、細(xì)胞核以及DNA，導(dǎo)致這些結(jié)構(gòu)的損傷，使細(xì)胞的功能受到損害。隨著Nov濃度的增高，細(xì)胞內(nèi)ROS水平也隨之增高，說明Nov能夠激活ROS。當(dāng)先用抗氧化劑NAC預(yù)處理細(xì)胞1 h，再加上Nov處理，從本實驗的結(jié)果可以看到ROS水平明顯降低，與對照組沒有明顯差異，證實Nov的確能夠誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生。Nov是否通過ROS途徑誘導(dǎo)DNA的損傷？通過流式檢測DNA損傷的標(biāo)志物r-H2AX以及修復(fù)蛋白Parp的變化，實驗結(jié)果表明，隨著藥物濃度的增加，r-H2AX表達(dá)隨著增加，Parp的切割成cleaved Parp也明顯增加，但預(yù)先用NAC處理1 h，會逆轉(zhuǎn)r-H2AX和Parp的變化，同樣蛋白免疫印跡結(jié)果也表明Nov能增加r-H2AX和Parp蛋白的切割，進(jìn)一步證實Nov是通過激活ROS進(jìn)而誘導(dǎo)DNA損傷。

Fig 5 Nov decreased mitochondrial membrane potential of K562 and k562／G01 cells（ˉx±s，n＝3）

Fig 6 Nov induced cell cycle G2／M phase arrest of both K562 and k562／G01 cells

細(xì)胞在遭受DNA損傷時，會激活DNA損傷應(yīng)答反應(yīng)［12］，包括激活細(xì)胞周期檢測點，使損傷細(xì)胞周期發(fā)生阻滯，為細(xì)胞啟動DNA損傷修復(fù)提供時間，Chk1和Chk2蛋白在細(xì)胞周期檢測過程中發(fā)揮重要的作用［13］，在細(xì)胞DNA發(fā)生損傷時，磷酸化而活化，識別細(xì)胞DNA損傷發(fā)生的時相，影響下游的相關(guān)蛋白的表達(dá)和修飾如抑癌基因產(chǎn)物p53的磷酸化等，使細(xì)胞阻滯某個周期時相。本實驗結(jié)果表明Nov能夠使 K562和 K562／G01細(xì)胞 DNA損傷，激活細(xì)胞周期檢測點功能，使Chk1和Chk2磷酸化，使細(xì)胞周期阻滯在G2／M期。CDC25A和CDC25C在維持細(xì)胞周期G2／M的正常功能發(fā)揮重要的作用［14］，在 正 常 的 細(xì) 胞 周 期 進(jìn) 程 中 CDC25A和CDC25C參與有絲分裂促進(jìn)因子MPF（mitosis-promoting factor or M-phase-promoting factor）［15］的形成，保證細(xì)胞能正確順利完成有絲分裂。當(dāng)CDC25A和CDC25C表達(dá)減少時，MPF復(fù)合物形成受阻，功能缺失，細(xì)胞不能跨過G2／M期完成有絲分裂進(jìn)程。從實驗結(jié)果可以看出Nov能夠明顯降低CDC25A和CDC25C的表達(dá)，是Nov誘導(dǎo)K562和K562／G01細(xì)胞周期阻滯在G2／M期的分子機制。當(dāng)DNA損傷不能有效修復(fù)，細(xì)胞便通過激活程序性死亡途徑，誘導(dǎo)凋亡［16］，本實驗結(jié)果證明，由于Nov的作用，DNA損傷修復(fù)蛋白Parp的切割增加，導(dǎo)致功能喪失，細(xì)胞不能及時正確完成修復(fù)功能，隨之啟動線粒體凋亡通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，表現(xiàn)為線粒體膜電位的降低、Cytometrome C釋放、Cleaved Caspase-3水平增加，流式凋亡檢測也表明隨著Nov濃度增加，細(xì)胞凋亡率隨之增加。

Fig 7 Nov increased the apoptotic ratio of both K562 and K562／G01 cells（ˉx±s，n＝3）

Fig 8 Effect of proteins expression on K562 and K562／G01 cells with Nov treatment

4 結(jié)論

Nov通過激活ROS，誘導(dǎo)K562及K562／G01細(xì)胞DNA的損傷，激活細(xì)胞周期檢測點，阻滯細(xì)胞于G2／M期，抑制損傷修復(fù)相關(guān)蛋白的功能，使受損細(xì)胞得不到及時有效的修復(fù)，激活線粒體凋亡通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

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