碘化N-正丁基氟哌啶醇抑制大鼠過氧化氫作用心肌細胞L型鈣通道電流的增大

黃勇攀，高分飛，石剛剛

（1.貴陽醫學院藥理學教研室，貴州貴陽 550004；2.汕頭大學醫學院藥理學教研室，廣東汕頭 515041）

鈣超載是缺血／再灌注損傷（I／R）重要機制之一。心肌I／R引起鈣通道開放，大量的鈣離子通過鈣通道進入心肌細胞，導致細胞內鈣超載。碘化N-正丁基氟哌啶醇（F2）是我們課題組合成的具有拮抗心肌I／R損傷作用，結構全新的氟哌啶醇季銨鹽衍生物，研究發現F2能阻斷正常心肌細胞鈣通道及抑制缺氧條件下鈉鈣交換體電流防止鈣超載，減輕大鼠和家兔心肌 I／R損傷［1－3］。但是 F2對過氧化氫作用ICa，L的作用還不清楚。本研究通過建立過氧化氫作用模型來模擬心臟I／R氧自由基損傷ICa，L變化并探討F2對I／R ICa，L作用及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物 成年♂ SD大鼠，體質量180～250 g，汕頭大學醫學院動物實驗中心提供，動物合格證號：2004A062。

1.2 藥物和儀器 F2，由本研究室合成（分子質量559.61，純度98.6%），結構由中國科學院上海有機化學所鑒定，保存在 DMSO，濃度為0.1 mol·L－1；nifedipine、CsCl、HEPES和 BAPTA均購自 Sigma Chemical Co，St.Louis，MO；膜片鉗系統購自美國Axon公司；倒置顯微鏡購自日本OLYMPUS公司。

1.3 單個大鼠心室肌細胞的分離制備 SD大鼠斷頭，頸動脈放血，迅速取下心臟，在4℃無鈣液（mmol·L－1：NaCl 135，KCl 5.4，MgCl21.0，NaH2PO40.33，glucose 10，HEPES1.0，pH 7.4）中去除脂肪及心包膜，經主動脈進行Langendorff灌流。用無鈣液經主動脈逆行灌流約6 min，再用酶溶液0.4 g·L－1collagenase和0.06 g·L－1protease灌流 25 min直至心臟變得柔軟，松弛。整個灌流過程中保持37℃恒溫，持續通95%O2和5%CO2混合氣。剪下心肌，在 KB液（85 KOH，50 L-glutamic acid，30 KCl， 30 KH2PO4， 20 taurine， 1.0 MgCl2， 10 HEPES，1 EGTA，10 glucose）中輕柔吹打，直至大量細胞分離下來，得到細胞混懸液，貯存于4℃KB液中［4］。

1.4 鈣電流記錄 采用全細胞膜片鉗技術記錄心肌細胞鈣電流，室溫下進行。所用微電極用兩步拉制儀拉制而成，微電極充電極內液（mmol·L－1：150 CsCl，15 EGTA，1 MgCl2，5 MgATP，5 HEPES，CsOH調至pH7.2）后電阻在2～3 MΩ之間。心室肌細胞懸液置于浴槽中，靜置2 min貼壁，臺式液灌流5 min，流速2 ml·min－1。選取胞膜完整、橫紋清晰、桿狀，邊界清楚，無收縮的心室肌細胞進行實驗。調節微操縱器，將玻璃微電極置于細胞表面，給予負壓吸引形成1～10 GΩ的高阻封接，之后加大負壓使電極尖端部分的膜片破裂，形成全細胞式記錄方式。本實驗通道電流的記錄均在全細胞記錄方式形成穩定5 min后進行，以確保所記錄離子通道電流的穩定性。

1.5 過氧化氫作用模型的建立 通過轉換正常細胞外液到含過氧化氫（100μmol·L－1）的正常細胞外液5～10 min，持續5 min，灌流速度均維持在6 ml·min－1。

1.6 資料分析及數據處理 記錄電流在pCLAMP 8.2軟件中Clampfit 8.2程序里進行電流大小的測量和分析。實驗數據以ˉx±s表示。結果統計分析利用 SPSS 14.0軟件（SPSS Inc.，Chicago，Illinois 60606，USA），多個藥物濃度給藥前后結果比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）。

2 結果

2.1 心肌細胞的形態結構 倒置顯微鏡下可見分離的單個心室肌細胞，存活率約70%～80%，結構清晰，橫紋明顯，表面干凈，呈長桿狀（Fig 1）。

Fig 1 Cell morphology of isolated rat ventricular myocytes

2．2 過氧化氫作用后20 min內 ICa，L的“rundown”現象 電流（I）的強度衰減變化率用峰電流Imax與去極化200 ms時穩態電流的差值和峰電流Imax的比值來表示。心肌細胞（n＝6）破膜后過氧化氫分別作用5、10、15、20 min鈣電流抑制率變化（%），見Tab 1。

Tab 1 Attenuating changes of Ca2＋-currents（I peak）within 20 min（%）

2．3 F2對過氧化氫作用大鼠心室肌細胞ICa，L的影響 為排除所引 ICa，L中 K＋、Na＋電流的干擾，記錄ICa，L的細胞外液中以TEA-Cl和CsCl分別取代NaCl和KCl，電極內液亦用 Cs＋取代 K＋。鉗制電壓（holding potential）設置為 －40 mV，以失活 T-型鈣通道和鈉通道。以0.2 Hz的刺激頻率，300 ms的方波以10 mV遞增去極化到－30 mV～＋70 mV，引出內向電流后加入37.5μl 0.2 mmol·L－1維拉帕米，電流被抑制，表明所檢測電流為 ICa，L。從 ICa，L的 I-V關系曲線可知，ICa，L在去極化至＋10 mV左右達最大，反轉電位在＋60 mV～＋70 mV之間（Fig 2）。結果表明過氧化氫作用后心室肌細胞ICa，L峰值明顯增大。F2（0.1、1、10μmol·L－1）濃度依賴地抑制過氧化氫所致 ICa，L增大，其抑制率分別為（37.50±2.81）%，（54.83±2.93）%，（70.21±2.03）%（P＜0.05）。在－40 mV鉗制電壓條件下，以10 mV為階躍，自－30～70 mV給予測試電壓，記錄各測試電壓下ICa，L，以電流峰值對測試電壓作圖，得到鈣電流I-V曲線（Fig 2）。過氧化氫作用后鈣電流I-V曲線下降，形狀無變化，提示過氧化氫作用后心室肌細胞 ICa，L內流增大，F2作用后 ICa，LI-V曲線上移。

Fig 2 Effect of F2 on I Ca，L during H 2 O2 exposure

3 討論

目前對離子通道的研究通常采用膜片鉗全細胞記錄技術直接觀察研究通道電流的變化。我們課題組先前膜片鉗實驗觀察了F2對正常生理狀態下L型鈣通道及鉀通道的作用，發現F2能濃度依賴地抑制鈣通道和鉀通道［5－6］。本實驗通過建立過氧化氫模型來模擬心肌缺血／再灌注，觀察此過程中ICa，L的變化。為了準確記錄實驗過程中F2對L-型鈣通道的阻斷作用，首先觀察了鈣電流記錄過程中常見的鈣電流衰減現象（“rundown”現象）［7－9］。在實驗過程中我們發現過氧化氫作用心肌細胞后對L型鈣通道電流的衰減情況影響較大，因此本實驗記錄過氧化氫作用后鈣電流20 min內的衰減變化情況，發現其衰減情況并不嚴重影響到藥物對通道電流的作用。但是40 min后ICa，L衰減明顯。因此我們選定過氧化氫作用15 min開始記錄鈣電流。此外，為了保證在記錄電流期間出現的實驗效應比較穩定，我們在電極內液中加入了高濃度的EGTA（10 mmol·L－1）和 ATP（5 mmol·L－1），這樣可保證電流在記錄時間內衰減不明顯。

在心肌缺血／再灌注過程中，大量產生的過氧化氫，參與I／R病理過程，并在其中發揮著重要作用。氧自由基可導致細胞膜的損傷，過氧化氫作為其中一種相對穩定的氧自由基，能快速擴散進入細胞并引起一系列細胞功能的改變，其標志是動作電位時程的延長，L-型鈣通道的明顯開放［10－11］。大量的Ca2＋通過開放的鈣通道進入細胞，引起細胞內的Ca2＋濃度增加，進而導致細胞鈣超載。本研究顯示過氧化氫引起L-型鈣通道電流的明顯增大，增大率為（33.65±1.90）%，且鈣電流I-V曲線下降。F2阻斷過氧化氫所致的心肌細胞膜明顯開放的L-型鈣通道，ICa，LI-V曲線上移。前期研究發現F2具有阻斷正常狀態下心肌細胞L-型鈣通道及具有拮抗I／R心肌氧化應激的作用［12－14］，綜合本研究結果，我們有理由推測F2對過氧化氫作用狀態下心肌細胞L-型鈣通道可能具有直接及間接的調整作用。

綜上所述，F2抑制過氧化氫作用引起的心肌細胞ICa，L的增大，減少病理狀態下鈣離子內流，降低胞內鈣離子濃度，從而發揮對缺血心肌組織的保護作用。這提示F2對調節氧自由基紊亂和改善心肌鈣穩態有重要作用并有著較好的開發前景。

參考文獻：

［1］Zhou Y，Shi G，Zheng J，et al.The protective effects of Egr-1 antisense oligodeoxyribonucleotide on cardiac microvascular endothelial injury induced by hypoxia-reoxygenation［J］.Biochem Cell Biol，2010，88（4）：687－95.

［2］Huang Z，Li H，Guo F，et al.Egr-1，the potential target of calcium channel blockers in cardioprotection with ischemia／reperfusion injury in rats［J］.Cell Physiol Biochem，2009，24（1-2）：17－24.

［3］Zhou Y，Zhang Y，Gao F，et al.N-n-butyl haloperidol iodide protects cardiac microvascular endothelial cells from hypoxia／reoxygenation injury by down-regulating Egr-1 expression［J］.Cell Physiol Biochem，2010，26（6）：839－48.

［4］劉妍妍，白云龍，王 濤，等.白藜蘆醇對豚鼠心室肌細胞L型鈣通道的影響 ［J］.中國藥理學通報，2007，23（2）：181－4.

［4］Liu Y Y，Bai Y L，Wang T，et，al.Effects of resvertrol on L-type calcium channles of guinea pig ventricular myocytes［J］.Chin Pharmacol Bull，2007，23（2）：181－4.

［5］高分飛，石剛剛，鄭錦鴻，等.碘化N-正丁基氟哌啶醇對大鼠心室肌細胞膜鉀通道的影響［J］.中國藥理學通報，2007，23（7）：891－5.

［5］Gao F F，Shi G G，Zheng J H，et al.Effects of N-n-butyl haloperidol iodide on on rat myocardial potassium channels［J］.Chin Pharmacol Bull，2007，23（7）：891－5.

［6］黃展勤，石剛剛，鄭錦鴻，等.碘化N-正丁基氟哌啶醇對大鼠心室肌細胞L型鈣通道的阻斷作用［J］.中國藥理學通報，2006，22（6）：702－5.

［6］Huang Z Q，Shi GG，Zheng JH，et al.Effects of N-n-butyl haloperidol iodide on on rat myocardial L-type calcium channels［J］.Chin Pharmacol Bull，2006，22（6）：702－5.

［7］Bers D M，Perez-Reyes E.Ca channels in cardiac myocytes：structure and function in Ca influx and intracellular Ca release［J］.Cardiovasc Res，1999，42（2）：339－60.

［8］Zhen X G，Xie C，Yamada Y，et al.A singleamino acid mutation attenuates rundown of voltage-gated calcium channels［J］.FEBS Lett，2006，580（24）：5733－8.

［9］Xu JJ，Hao L Y，Kameyama A，et al.Calmodulin reverses rundown of L-type Ca（2＋）channels in guinea pig ventricular myocytes［J］.Am J Physiol Cell Physiol，2004，287（6）：C1717－24.

［10］Ward CA，Giles WR.Ionic mechanism of the effects of hydrogen peroxide in rat ventricular myocytes［J］.JPhysiol，1997，500（Pt 3）：631－42.

［11］Thomas G P，Sims SM，Cook M A，et al.Hydrogen peroxide-induced stimulation of L-type calcium current in guinea pig ventricular myocytes and its inhibition by adenosine A1 receptor activation［J］.J Pharmacol Exp Ther，1998，286（3）：1208－14.

［12］Huang Z，Shi G，Gao F，et al.Effects of N-n-butyl haloperidol iodide on L-type calcium channels and intracellular free calcium in rat ventricular myocytes［J］.Biochem Cell Biol，2007，85（2）：182－8.

［13］Gao F F，Hao SY，Huang Z Q，et al.Cardiac electrophysiological and antiarrhythmic effects of N-n-butyl haloperidol iodide［J］.Cell Physiol Biochem，2010，25（4－5）：433－42.

［14］Huang Z Q，Shi GG，Zheng JH，et al.Effects of N-n-butyl haloperidol iodide on rat myocardial ischemia and reperfusion injury and L-type calcium current［J］.Acta Pharmacol Sin，2003，24（8）：757－63.