表達白介素-23基因的重組純化及其對妊娠期哮喘氣道炎癥狀態(tài)下免疫應(yīng)答產(chǎn)生的影響

馬佳佳，Nick Lu，陳必良

（1.第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院婦產(chǎn)科，陜西西安 710032；2.Department of Allergy-immunology，Northwestern University，USA Chicago 60611）

妊娠合并哮喘是妊娠合并癥中一種炎癥潛伏與反復(fù)發(fā)作免疫應(yīng)答過程尚未明確的常見疾病［1］。由于妊娠期母體特有的生理狀態(tài)和炎癥的持續(xù)感染反復(fù)遷延，引發(fā)免疫應(yīng)答異常導(dǎo)致的孕期并發(fā)癥，表現(xiàn)為肺組織病理損傷、胎兒低出生體重、早產(chǎn)危險性［2］等，均對母嬰安全和機體免疫系統(tǒng)的自身穩(wěn)定產(chǎn)生影響。白細胞介素-23（interleukin-23，IL-23）具有前炎癥反應(yīng)活性［3］，通過結(jié)合靶細胞膜上IL-23受體，依賴致病CD4＋T細胞亞群，廣泛參與體內(nèi)免疫過程，調(diào)節(jié)免疫細胞分化，刺激并特異性促進相關(guān)因子表達［4］，因在多種肺部疾病炎癥形成以及靶組織病理生理反應(yīng)中的作用而成為近年來的研究熱點［5］。本研究利用大腸桿菌表達的 IL-23重組蛋白，通過轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞聚集定位和體外轉(zhuǎn)移鑒定，探討IL-23-IL-23R-IL-17炎性通路激活及其Th細胞線性家族平衡偏移特異性靶分子參與妊娠期哮喘發(fā)病的可能機制，為以IL-23為靶向，尋找針對其引發(fā)炎癥反應(yīng)臨床免疫干預(yù)治療的新策略提供新思路。

1 材料

1.1 主要試劑 pMD18-T、pCEP4、E.coilDH5a、BL21（DE3）、肥大細胞株P(guān)815均由美國芝加哥西北大學(xué)過敏和免疫學(xué)系Nick Lu博士饋贈；pEGFPN1質(zhì)粒（美國 Invitrogen）；T4 DNA連接酶（大連TaKaRa）；限制性內(nèi)切酶、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropylβ-D-1-thiongalactopyranoside，IPTG）（美國 Amresco）；Glutathione Sepharose 4B（美國 Pharmacia Biotech）；凝膠電泳遷移率變動（EMSA）試劑盒（美國 Pierce）；熒光標記抗 FITC-CD4、CD25，抗PE-IFN-γ、IL-4、IL-17A，抗 PE-Cy5-FoxP3 mAb及同型對照（美國 BD／Pharmingen）；小鼠 IL-17A ELISA檢測試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）。

1.2 動物與標本 SPF級♀ BALB／c小鼠48只，6～8周齡，體質(zhì)量18～20 g／只（第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供）；妊娠期哮喘婦女清晨空腹外周血采自第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院婦產(chǎn)科就診自愿者。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會討論通過。

2 方法

2．1 目的基因擴增及p40＋p19雙亞基表達載體構(gòu)建 根據(jù)GeneBank中IL-23 cDNA序列和p40／p19 mRNA參考序列設(shè)計引物，并委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司合成。p19F：5′-GAGCACCGGTCGCACCAGCAACCCTGAGTCCCTA-3′（下劃線為KpnⅠ酶切位點，雙下劃線為表達增強序列），p19R：5′-CAAAGCTCGAGTTCCCTTCCCATCTAATA A-3′（下 劃 線為 XhoⅠ 酶 切位 點）；p40F：5′-GCTAGTCGATGGTGAGCCGTGAT-3′（下劃線為NotⅠ 酶 切 位 點 ），p40R：5′-CATGACCGGCTAATGAGAAAGGGATT-3′（下劃線為KpnⅠ酶切位點，雙下劃線為表達增強序列）。

以 p19F／p19R、p40F／p40R為引物 PCR擴增IL-23基因p19和p40雙亞基cDNA全長。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性 5 min；94℃30 s、61℃30 s、72℃1 min，30個循環(huán)后72℃延伸10 min。凝膠電泳鑒定并以兩者擴增產(chǎn)物為模板，p19F／p40R為引物完成重疊PCR擴增，反應(yīng)條件同上。將純化產(chǎn)物分別克隆于pMD18-T載體，PmeⅠ酶切pMD18-T-p19／p40 DNA凝膠回收片段先后插入pCEP4載體，T4連接酶過夜連接后經(jīng)轉(zhuǎn)化、鋪板篩選、挑取克隆菌落擴增并提取質(zhì)粒，Pac I酶切和測序鑒定最終獲得重組pCEP4-IL-23（p19＋p40）命名為 pCEP4-IL-23。

2.2 重組蛋白誘導(dǎo)表達及產(chǎn)物純化鑒定 挑取重組質(zhì)粒和空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coilBL21單菌落，于卡那霉素LB液體培養(yǎng)基中220 r·min－1，37℃振搖過夜，至菌液波長A600nm值為0.5～0.6時，取1 ml菌液作為誘導(dǎo)前對照，剩余菌液中加入IPTG終濃度0.5 mmol·L－122℃誘導(dǎo)表達4 h，離心收集超聲裂解菌體上清0.22μm濾膜過濾，與預(yù)包被GST蛋白的Glutathione Sepharose 4B凝膠顆粒4℃反應(yīng)過夜，3次重復(fù)上樣。以預(yù)冷PBS洗脫未結(jié)合蛋白15 min×4次，收集梯度透析復(fù)性過濾產(chǎn)物進行SDS-PAGE電泳和蛋白質(zhì)印跡鑒定。

2.3 重組蛋白介導(dǎo)轉(zhuǎn)染及結(jié)合效應(yīng)檢測 對數(shù)生長期P815細胞以1×106／孔接種24孔板，37℃培養(yǎng)過夜至細胞豐度達80%～90%。轉(zhuǎn)染前1 h吸去培養(yǎng)液，用5%葡萄糖和去離子水分別溶解純化的重組蛋白與pEGFP-N1質(zhì)粒，調(diào)濃度0.2 g·L－1。蛋白／質(zhì)粒按 0、0.5、1.0、3.0、5.0、7.0不同質(zhì)量比輕柔混均反應(yīng)24 h，37℃水浴后將收集的蛋白／DNA復(fù)合液瞬時轉(zhuǎn)入實驗細胞繼續(xù)培養(yǎng)，每一質(zhì)量比設(shè)3個平行孔。12 h后加入1 mg·L－1LPS，設(shè)LPS刺激前為0 d。分別于轉(zhuǎn)染后d 2、d 3、d 4熒光顯微鏡觀察并收集圖像。提取細胞總蛋白以anti-GST抗體檢測目的蛋白表達；比較兩者EMSA反應(yīng)按試劑盒說明書操作進行，以單純pEGFP-N1質(zhì)粒與細胞共培養(yǎng)作為對照。

2.4 重組蛋白生物學(xué)功能檢測

2.4.1 體內(nèi)表達檢測 妊娠哮喘小鼠模型制備參照文獻［6］的方法完成并隨機分為4組。以尾靜脈快速注射方式，按預(yù)實驗確定的方案，單純模型組（A組）注入50μl生理鹽水；LPS組（B組）注入1 mg·L－1LPS；空載蛋白＋LPS組（C組）和純化重組蛋白＋LPS組（D組）分別注入 50μl GST／pCEP4和GST／pCEP4-IL-23后再給予 1 mg·L－1LPS刺激。分別于注射后d 2、d 4、d 7、d 14和d 21行小鼠眼眶靜脈叢取血（n＝6），血清IL-17A含量測定按ELISA試劑盒說明書進行；7 d時切取小鼠肺組織（n＝6）4%多聚甲醛固定后石蠟包埋、切片（4～6μm）、常規(guī)HE染色后光鏡觀察并拍照。

2.4.2 體外表達檢測 完全RPMI 1640培養(yǎng)液懸浮Ficoll法分離獲得的患者外周血單個核細胞（2×106·L－1），置于預(yù)包被 CD3 mAb 24孔板與 20μg·L－1佛波酯、10μg·L－1離子霉素混均 37℃孵育 6 h，實驗組加入純化重組蛋白或空載蛋白4℃條件共培養(yǎng)5 d，對照細胞不做任何處理。按試劑說明每孔先后加入飽和濃度的 FITC-CD4、CD25，PE-IFN-γ、IL-4、IL-17A和PE-Cy5-Foxp3抗體及同型對照，4℃避光反應(yīng)30 min，PBS／多聚甲醛重懸細胞后進行流式細胞術(shù)（FCM）檢測，以上步驟重復(fù)3次。

2.5 統(tǒng)計學(xué)分析 重復(fù)實驗獲得的數(shù)據(jù)以ˉx±s表示并使用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件進行分析。數(shù)據(jù)多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析；兩組間樣本均數(shù)比較采用LSD-t檢驗。

3 結(jié)果

3.1 重組穿梭載體構(gòu)建與鑒定 p19和p40重組克隆的PCR擴增產(chǎn)物大小為250 bp，均與預(yù)期cDNA相符。兩者先后插入pMD18-T載體并在分子量約240 bp（p19）和 240 bp（p40）處產(chǎn)生的清晰特異條帶與p19和p40亞基DNA長度吻合（Fig 1）。

Fig 1 Cloning the target gene and enzyme digestion of the shuttle plasmid

3.2 重組真核雙表達載體構(gòu)建與鑒定 將p19和p40全長基因混合后與pCEP4載體連接，經(jīng)重疊PCR及酶切鑒定，連接成功的陽性克隆能夠釋放大小約250 bp（p40＋p19）片段（Fig 2），測序結(jié)果表明重組真核表達質(zhì)粒中插入的目的基因序列無突變。

3.3 重組蛋白的表達和純化 經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達，含有重組質(zhì)粒的菌液粗蛋白可溶性較好，GST／pCEP4-IL-23表達的分子質(zhì)量在約36 000出現(xiàn)的顯影條帶與預(yù)期分子理論值相符（Fig 3A），層析純度達95%以上；其表達產(chǎn)物與GST發(fā)生的特異性結(jié)合反應(yīng)，對應(yīng)了96 ku處濃重清晰顯色條帶的分子質(zhì)量大小（Fig 3B），未誘導(dǎo)對照及GST／pCEP4顯色較弱，可用于后續(xù)實驗。

Fig 2 PCR identification of recombinant expression plasmid of cloning

Fig 3 Genetically engineered bacteria and protein chromatography induced effects

3．4 重組蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)活性及DNA競爭結(jié)合遷移變化 顯微鏡下觀察到重組蛋白能夠?qū)①|(zhì)粒DNA高效攜入靶細胞。LPS刺激前EGFP基因以彌散狀態(tài)分布，刺激后隨時間的延長，EGFP表達形成多個熒光聚集且強度增高明顯（Fig 4A）；Western blot顯示分子質(zhì)量約96 ku的蛋白條帶 （Fig 4B），單純質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞LPS刺激前后EGFP及蛋白表達均未見明顯變化。

EMSA顯示，LPS刺激指示出轉(zhuǎn)染細胞核蛋白的DNA結(jié)合活性隨蛋白／質(zhì)粒相對質(zhì)量比的增加而明顯變化。核蛋白提取物中的大分子復(fù)合體含量越高，其顯影位置凝膠遷移速率越低，區(qū)帶電泳滯后可將質(zhì)粒DNA完全阻滯于加樣孔中，表明蛋白中和DNA兩者的結(jié)合是特異的；單純質(zhì)粒的DNA結(jié)合活性很弱，由于不能與標記探針競爭抑制核蛋白，而呈現(xiàn)清晰的顯影條帶（Fig 5）。

Fig 4 Expression validation of cell activity after gene transfection

Fig 5 Electrophoretic mobility shift assay

3.5 重組蛋白的體內(nèi)持續(xù)表達對局部炎性改變影響 D組注射4～6 d后血清中IL-17A含量明顯高于A、B、C 3組，之后開始回落且逐漸穩(wěn)定，至21 d時幾乎為0（P＜0.05，F(xiàn)ig 6）；其肺組織炎性細胞浸潤、肺泡間隔擴大、粘膜上皮增生等過度炎癥損傷最為明顯。B、C組血清IL-17A水平及肺組織炎性病理改變明顯小于D組但強于A組（Fig 7）。

3．6 重組蛋白體外誘導(dǎo)對T細胞亞群分布及比例變化影響 與未經(jīng)處理的對照細胞相比較，GST／pCEP4-IL-23組除 IFN-γ、FoxP3細胞數(shù)下降，IL-4細胞數(shù)以及 Th2／Th1比例升高外，IL-17A細胞和Th17／Treg比例亦明顯增多、增高（P＜0.05，F(xiàn)ig 8）；GST／pCEP4組與對照細胞間的差異無顯著性。

Fig 6 Detection of IL-17A level in serum by ELISA analysis（n＝6，ng·L－1，ˉx±s）

Fig 7 Morphology of lung tissue in different mice groups（HE ×100）

4 討論

長期以來的觀點認為，支氣管哮喘發(fā)病過程中最重要的免疫異常是Th1／Th2相互拮抗和自身促進的平衡狀態(tài)被打破。然而，Th1／Th2失衡學(xué)說這一模式化理論并不能解釋哮喘免疫學(xué)基礎(chǔ)與臨床研究中的全部現(xiàn)象［7］。隨著哮喘發(fā)病機制研究的深入以及免疫、分子生物學(xué)的發(fā)展，一種新的假說，即炎癥和自身免疫性疾病的發(fā)生和發(fā)展可能是T輔助細胞反應(yīng)從Th2、Treg向Th17或者Th1偏移所引起；而阻斷關(guān)鍵性細胞因子可使免疫反應(yīng)從Th17／Th1表型向 Treg和 Th2轉(zhuǎn)換［8］。近來研究［5］證實，Th17的上游調(diào)控因子IL-23是具有與IL-12功能相似但更為有效、復(fù)雜的效應(yīng)分子。通過趨化炎癥細胞聚集與遷移，導(dǎo)致T細胞反應(yīng)擴增以及過表達產(chǎn)生的IL-23／IL-17式瀑布效應(yīng)等，均可造成母體多組織炎癥損害、矮小綜合癥、不育和（或）早產(chǎn)死亡［1］。而這一現(xiàn)象能夠解釋在發(fā)現(xiàn)Th17前的某些自身免疫性疾病模型中出現(xiàn)的理論偏差現(xiàn)象。

IL-23的免疫調(diào)控機制十分復(fù)雜，其異源二聚體產(chǎn)生以及生物學(xué)作用的發(fā)揮需要編碼p40和p19兩種亞基的同時表達［3］。為此，本研究首先采用基因分子拼接技術(shù)通過連接肽基因，成功擴增并將p40／p19亞基片段融合拼接在pCEP4載體上；預(yù)期編碼抗原基因IL-23的重組蛋白表達純化后，可穿透胞膜將外源質(zhì)粒攜入細胞并轉(zhuǎn)位于胞核，在相關(guān)DNA結(jié)合位點上形成穩(wěn)定復(fù)合體，通過大分子轉(zhuǎn)運以及調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)過程來抑制核蛋白的遷移。上述結(jié)果確證作者選擇載體的多克隆位點不僅便于目的基因的插入，蛋白介導(dǎo)基因跨膜轉(zhuǎn)運直接或間接的功能作用，實現(xiàn)EGFP基因的穩(wěn)定表達，增加外源物質(zhì)的DNA結(jié)合活性，為探討重組蛋白免疫功能對IL-23基因表達影響，從細胞轉(zhuǎn)錄水平闡明其與妊娠哮喘抗感染免疫的可能機制奠定實驗基礎(chǔ)，也為生物大分子藥物進入組織細胞內(nèi)發(fā)揮治療作用提供新的思路。

Fig 8 Evaluation of recombinant protein in vitro by FCM（ˉx±s，n＝6）

在闡明IL-23／IL-17為主軸的免疫調(diào)節(jié)途徑與妊娠期哮喘發(fā)病的可能作用及機制方面，實驗制作妊娠哮喘小鼠模型，通過體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)活性檢測發(fā)現(xiàn)所表達的重組蛋白表現(xiàn)出比對照蛋白更高的活性，經(jīng)尾靜脈注射14 d后小鼠血清中仍可觀察到IL-17A的存在，由此產(chǎn)生免疫網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)系統(tǒng)功能紊亂引發(fā)肺組織病理損傷改變增多等，可能是外源性蛋白激活I(lǐng)L-23R信號位點并有效在宿主染色體上整合而不易被降解清除，導(dǎo)致Th17分化增強和IL-17表達增多。除此之外實驗進一步觀察發(fā)現(xiàn)，增加小劑量的LPS，使刺激升高的IL-23R磷酸化水平通過增強p19／p40亞基轉(zhuǎn)錄活性，上調(diào)了IL-23基因病理性表達［9］，而空載蛋白即使增加LPS及單純LPS誘導(dǎo)，均未能達到相同效果。筆者認為，活化IL-23啟動的炎癥通路導(dǎo)致免疫平衡向Th17偏移具有一定的相關(guān)性。在一定程度上加劇了炎癥細胞的浸潤與黏附，改變了妊娠哮喘孕婦的局部微環(huán)境，是導(dǎo)致母體慢性炎癥反復(fù)發(fā)生的關(guān)鍵所在。筆者的研究表明細胞反應(yīng)的調(diào)節(jié)是可誘導(dǎo)的［10］；IL-23-IL-23R-Th17-IL-17炎癥軸在妊娠哮喘發(fā)生、發(fā)展過程中存在功能改變，破壞了妊娠哮喘母體自身組織和抗原的免疫耐受，證實其活化和優(yōu)勢應(yīng)答可致妊娠期哮喘發(fā)病這一機制。

本研究體外細胞實驗測定IL-23促炎癥效應(yīng)發(fā)現(xiàn)，患者外周血中除存在Th2／Th1失平衡外，還同時存在Th17表達增高和Treg數(shù)量減少，提示純化重組蛋白發(fā)揮的免疫干擾特性抑制Th1、Treg細胞復(fù)制，促進Th2、Th17細胞生成。由此推測，Th1反應(yīng)向Th2反應(yīng)轉(zhuǎn)化與Th17／Treg比值升高變化共同參與妊娠期哮喘異常免疫反應(yīng)調(diào)解，使母體和胎兒自體反應(yīng)性CD4＋T細胞抑制功能降低［11］和（或）呈低反應(yīng)性；激活的相關(guān)致炎因子以過度釋放方式造成炎癥損傷擴大并持久存在，增加妊娠哮喘母體對病毒的易感性［12］，促發(fā)孕婦罹患哮喘的幾率，加重感染后疾病的嚴重程度；而免疫功能亢進和免疫應(yīng)答失平衡的雙向性變化，最終導(dǎo)致妊娠期哮喘的多種并發(fā)癥。作者的研究結(jié)果及觀點進一步證實CD4＋T細胞不同亞群在分化過程中和功能上存在相互抑制，支持Th1／Th2／Th17／Treg細胞線性家族間精細而復(fù)雜的平衡狀態(tài)決定疾病形成和進展的發(fā)現(xiàn)。

總之，闡明IL-23與其他免疫細胞亞群之間平衡的調(diào)節(jié)機制以及對機體免疫狀態(tài)的影響，對于改善甚至逆轉(zhuǎn)妊娠哮喘慢性氣道炎癥反應(yīng)的藥物開發(fā)和探索新的治療靶點具有重要意義。

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