黃芪甲苷抑制GSK-3β活性介導大鼠心肌缺血／再灌注損傷作用的線粒體機制研究

賀永貴，李王芳，伊紅麗，鄭 桓，習瑾昆

（1.河北聯合大學附屬醫院；2.河北聯合大學心臟研究所，中匈合作中醫藥實驗室，唐山市新藥基礎研究重點實驗室，河北唐山 063000）

急性心肌梗死引起的心肌缺血／再灌注損傷（myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI），嚴重危害人類健康，急需對其機制進行探討以指導臨床治療。黃芪是一種多年生草本植物，為豆科植物蒙古黃芪或膜莢黃芪的干燥根。黃芪甲苷（Astragaloside IV）是從黃芪中分離提取的重要生物活性成分之一，臨床應用廣泛，研究證實黃芪甲苷具有明顯的心肌保護作用［1］。本研究觀察MIRI時心功能和心肌梗死面積的變化，并給予黃芪甲苷干預以探討其對大鼠MIRI的保護作用，在以往研究的基礎上進一步探討其對MIRI的線粒體保護機制，為黃芪甲苷的心肌保護作用提供可靠的實驗依據。

1 材料

1.1 動物 實驗用♂ Wistar大鼠，體質量250～350 g，由北京維通利華實驗動物中心提供，實驗動物使用許可證號：SYXK（冀）2010－0038。

1.2 主要材料與試劑 黃芪甲苷購自天津馬克生物技術有限公司（批號：HQJG-20110507）。mPTP開放劑蒼術苷（atractyloside）和抑制劑環孢素A（cyclosporin A，CsA）購自Sigma-Aldrich公司。磷酸化-GSK-3β（Ser9）抗體、Total-GSK-3β抗體購自美國Cell Signaling Technology公司。辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG、BCA蛋白濃度測定試劑盒、ECL發光檢測試劑盒購自碧云天生物技術研究所。

1.3 儀器 Langendorff體外心臟灌流系統、數據采集分析系統（成都儀器廠）；電泳儀（Invitrogen公司）；生物圖像采集系統（美國UVP公司）；電鏡（日本日立公司）。

2 方法

2.1 實驗分組及動物模型制備

2.1.1 實驗分組 健康♂ Wistar大鼠，隨機分為對照組、黃芪甲苷組、mPTP開放劑組及抑制劑組。

2.1.2 動物模型制備 Lengandorff系統建立大鼠MIRI模型。將♂ Wistar大鼠（250～350 g）用苯巴比妥鈉（100 mg·kg－1）及肝素（2 mg·kg－1）腹腔注射麻醉后，開胸取心臟，立即放入盛有預冷生理鹽水的平皿內，沖掉殘留血液，并迅速懸掛于非循環的Langendorff灌流裝置上，行主動脈逆行灌流（Kerbs-Henseleit緩沖液）。灌注穩定20 min后，用5-0絲線穿于冠狀動脈周圍，以造成局部缺血。再灌注時，松開小止血鉗即可。

2.2 心功能指標測定 通過生物信號采集處理系統獲得數據，觀察缺血／再灌注過程中大鼠心臟在平衡末、缺血30 min、再灌注120 min時的心率（heart rate，HR）、左心室發展壓（left ventricular-developed pressure，LVDP）、左室舒張末期壓力（end diastolic pressure，EDP）；在上述時點收集冠脈流出液，計時1 min，測量冠脈流出量（coronary flow，CF）。

2.3 電鏡觀察心肌組織超微結構 取再灌注心肌組織（結扎線以下左前下壁），4%多聚甲醛固定，電鏡觀察。

2.4 心肌梗死面積測定 再灌注120 min時，再次結扎冠狀動脈（永久性），由主動脈逆行注入高分子熒光微球以區分梗死區。取出心臟，剪去多余血管和脂肪，稱心臟重量，在－20℃冰箱凍存2 h。取出冷凍的心臟，從心尖至心底沿心臟橫軸快速切成1 mm的心臟組織切片，游離出每個左心室組織切片置于1%TTC磷酸鹽緩沖液中（pH＝7.4），恒溫37℃孵育20 min后，浸入10%的福爾馬林溶液，以提高染色和非染色組織的對比度。此時可見紅色為非心肌梗死區，灰白色不著色組織為心肌梗死區。將心臟組織切片放在兩塊玻璃板中間并壓平，紫外光下描出標本和缺血區輪廓，觀察梗死面積。梗死區和危險區繪圖于透明塑料膜上，用Image Tool軟件量化。梗死面積／%＝梗死區／危險區×100%

2．5 線粒體分離及Ca2＋誘導的腫脹實驗 用差速離心法分離線粒體和胞質成分。心臟組織懸浮于組織勻漿緩沖液中（250 mmol·L－1蔗糖，10 mmol·L－1Tris-HCl（pH 7.4），1 mmol·L－1EDTA，1 mmol·L－1釩酸納，1 mmol·L－1氟化鈉，蛋白酶抑制劑，4℃保存，使用前加入釩酸納、氟化鈉、蛋白酶抑制劑）。充分混勻后置于冰上10 min。將勻漿液于4℃離心10 min（1 000×g）；棄沉淀即細胞核和細胞碎片，轉移上清至一新的離心管中，于4℃離心30 min（10 000×g）；棄去少量沉淀后將上清液于4℃繼續離心60 min（10 000×g），上清液為純凈細胞質成分，沉淀物為線粒體。將線粒體重懸于預冷的PBS緩沖液中，于4℃離心30 min（10 000×g），得到純凈線粒體。采用BCA蛋白定量試劑盒進行線粒體濃度分析。新鮮線粒體懸浮于腫脹緩沖液中（120 mmol·L－1KCl，10 mmol·L－1Tris-HCl，5 mmol·L－1KH2PO4，20 mmol·L－1MOPS，4℃），使線粒體終濃度達到0.3 g·L－1，并接種于96孔板中，加入200μmol·L－1CaCl2誘導 mPTP開放，用分光光度法測量520 nm吸收光降低的百分率來評價線粒體的腫脹程度。

2．6 Werstern blot檢測磷酸化-GSK-3β蛋白表達提取缺血／再灌注心肌組織總蛋白，用BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白濃度測定。每孔以60μg蛋白上樣，電泳并轉膜。10%脫脂牛奶室溫封閉30～60 min，磷酸化-GSK-3β及單克隆抗體（1∶1 000稀釋）4℃孵育過夜。二抗（1∶1 000稀釋）室溫孵育1 h后，ECL熒光顯色。用總蛋白（Total-GSK-3β）進行內參檢測。將X線片用Mixrotek Scan Wizard掃描軟件進行電腦掃描，Image J圖像分析軟件對條帶進行灰度掃描及定量分析。

2.7 統計學分析 實驗數據采用SPSS 17.0統計軟件進行統計學處理，所有實驗數據均用ˉx±s表示。顯著性差異采用完全隨機設計的單因素方差分析（one-way ANOVA）。

3 結果

3.1 黃芪甲苷對缺血／再灌注心臟心功能的影響對照組和黃芪甲苷組間的基礎數據即結扎冠狀動脈之前的 HR、CF、LVDP、EDP等差異無顯著性（Tab 1）。但再灌注120 min時，黃芪甲苷組的CF、LVDP明顯高于對照組（P＜0.05）（Fig 1）。

3.2 黃芪甲苷對心肌超微結構的影響 缺血／再灌注造成了心肌線粒體損傷，主要為線粒體腫脹及空泡變性。而黃芪甲苷組線粒體損傷明顯減輕（Fig 2）。

Tab 1 Hemodynamic data（ˉx±s）

Fig 1 Effect of Astragaloside IV on cardiac contractile function at reperfusion

3.3 黃芪甲苷對心肌梗死面積的影響 與對照組相比，黃芪甲苷明顯減少心肌梗死面積。黃芪甲苷的這種抗梗死作用被mPTP開放劑atractyloside所逆轉，說明黃芪甲苷通過抑制mPTP開放來保護再灌注心臟（Fig 3）。

Fig 3 Effect of Astragaloside IV on infarct size

3．4 黃芪甲苷對mPTP開放的影響 如Fig 4所示，在加入200μmol·L－1CaCl2后，對照組線粒體520 nm的吸光度明顯減少，提示高Ca2＋使mPTP開放而導致線粒體腫脹。相反，黃芪甲苷能夠模擬mPTP抑制劑CsA，明顯阻止Ca2＋誘導的吸光度減少，提示黃芪甲苷能夠抑制mPTP的開放。

3．5 黃芪甲苷對 GSK-3β磷酸化的影響 由于GSK-3β的失活能夠抑制mPTP的開放，因此本研究觀察了黃芪甲苷對離體心臟再灌注時GSK-3β-Ser9位點磷酸化的影響。結果如Fig 5所示，黃芪甲苷使再灌注5 min和10 min的GSK-3β磷酸化明顯增加，說明黃芪甲苷通過使GSK-3β失活而抑制mPTP的開放。

Fig 4 Effect of Astragaloside IV on mPTP opening

Fig 5 Effect of Astragaloside IV on GSK-3βphosphorylation

4 討論

黃芪甲苷是從中藥黃芪中分離得到的一種皂苷類化合物，是黃芪的重要活性成分。研究顯示［1］，黃芪甲苷具有心肌保護作用。然而，其保護心臟的具體細胞信號轉導機制尚不明確，尤其是心肌線粒體保護途徑的研究還比較少。后處理即有效緩解再灌注損傷，是決定MIRI預后的關鍵。本研究通過Lengandorff系統建立大鼠離體MIRI模型，觀察黃芪甲苷能否保護再灌注心臟及其可能的信號轉導機制。

通過生物信號采集系統進行心功能指標測定，結果顯示對照組和黃芪甲苷組間的基礎數據即結扎冠狀動脈之前的HR、CF、LVDP、EDP等差異并無顯著性。但再灌注120 min時，黃芪甲苷組CF、LVDP明顯高于對照組（P＜0.05），說明黃芪甲苷能夠改善再灌注心肌收縮功能。

線粒體的主要作用是通過氧化磷酸化生成ATP，供給細胞能量。近年來的研究表明，線粒體在心肌再灌注損傷中起關鍵性作用，這主要是因為線粒體膜上存在線粒體通透性轉移孔（mitochondrial permeability transition pore，mPTP）。在正常生理條件下mPTP閉合，阻止離子和代謝物質通透，從而保持線粒體的正常結構和功能。但在應激條件下（如缺血、缺氧），此孔被打開并允許分子質量小于1.5 ku的物質如H＋和水自由通過粒線體膜，最終以壞死和凋亡兩種方式損傷細胞。研究證實，mPTP在心肌缺血／再灌注損傷中起決定性作用［2－3］，而且mPTP開放發生在再灌注最初幾分鐘，而不是在缺血期［4］，說明再灌注初期是保護心臟的關鍵。最近研究證實，嗎啡［5］和白藜蘆醇［6－7］也通過抑制mPTP的開放而保護再灌注心肌。本研究電鏡結果顯示，黃芪甲苷能夠減輕再灌注引起的線粒體腫脹、空泡化，證實黃芪甲苷的心肌保護作用與線粒體有關。黃芪甲苷能夠明顯減少心肌梗死面積，其抗梗死作用被mPTP開放劑Atractyloside所抑制，說明黃芪甲苷通過阻止mPTP開放保護再灌注心臟。黃芪甲苷能夠模擬mPTP抑制劑CsA，明顯抑制Ca2＋誘導的線粒體腫脹，進一步證實黃芪甲苷通過抑制mPTP開放，保護再灌注心臟。

糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）的主要作用是通過磷酸化多種底物蛋白以調節糖原的合成代謝，并參與細胞增殖、分化和凋亡及細胞運動等生命過程［8］。GSK-3β受Ser9和Tyr216位點磷酸化的調節，Ser9磷酸化使GSK-3β活性降低，而靜息狀態時Tyr216磷酸化使GSK-3β活性增高［9］。研究顯示［7，10］，GSK-3β在心肌保護中具有非常重要的意義，其Ser9位點的磷酸化抑制其活性，進一步阻止mPTP的開放，是心肌保護的關鍵［9］。我們的前期研究顯示，嗎啡、白藜蘆醇、腺苷等［5，7，11］通過抑制 GSK-3β活性，阻止 mPTP開放，發揮心肌保護作用。本研究結果顯示，黃芪甲苷明顯增加再灌注GSK-3βSer9的磷酸化，提示抑制GSK-3β活性阻止mPTP開放，是黃芪甲苷心肌保護作用的機制之一。

本實驗結果顯示，黃芪甲苷可明顯增加再灌注心臟的CF、LVDP，明顯減少再灌注心肌線粒體腫脹及空泡化，明顯減少心肌梗死面積，明顯增加GSK-3β磷酸化水平。以上研究結果提示，黃芪甲苷可明顯改善再灌注心肌功能，減少心肌梗死面積，其機制可能與抑制GSK-3β活性，進而阻止mPTP開放有關。

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