FK506 binding protein 51參與糖皮質激素介導的抑郁樣行為的發生

陳 姣，楚世峰，李 婧，陳乃宏

（1.中國醫學科學院北京協和醫學院藥物研究所，北京 100050；2.天津中醫藥大學，天津 300193）

抑郁癥是一種常見的影響廣泛的精神疾病，常以興趣缺失、無助絕望、無力、無價值、注意力不集中、睡眠障礙等為臨床特征。應激在抑郁癥的發病機制中扮演著重要角色，它作為一種環境因素促使抑郁癥的發生和發展。在正常的生理狀態下，應激會激活HPA軸，導致腎上腺分泌糖皮質激素，應激過后糖皮質激素水平恢復到正常。這種短暫而平衡的HPA軸（下丘腦－垂體－腎上腺）活動為生物體提供了積極的應對反應。在應激過程中，HPA軸作為一個重要的調控系統起著平衡激素水平和應對應激的行為反應作用。HPA軸調控的一個重要信號是通過糖皮質激素與其受體結合發揮的對糖皮質激素的負反饋調節作用［1］。大量的研究表明HPA軸的負反饋調節作用，在長期處于應激環境中的抑郁患者身上是受到損傷的［2－3］。抑郁患者常常伴隨著體內糖皮質激素的升高和在地塞米松／促糖皮質激素釋放激素（Dex／CRH）結合試驗中對地塞米松抑制性反應的降低，對CRH的促分泌反應增強。成功的治療常常伴隨著HPA軸的正?；Ａ硗?，治愈的患者如果HPA軸的亢進未完全消除，存在著很大的復發的風險［4］。

HPA軸亢進最大的一個特點是糖皮質激素的大量分泌。在臨床上，庫欣綜合征患者體內糖皮質激素異常升高，表現出明顯的抑郁樣行為［5］。在實驗動物上也有相關報道［6］，有研究表明大量給予皮質酮能誘導動物的抑郁樣行為。例如，長期注射皮質酮在強迫游泳中能產生抑郁樣行為。同時，有研究［7－8］指出HPA軸亢進，糖皮質激素的負反饋調節受損，最終易導致與情感有關的腦區如前額葉皮質和海馬的結構和功能的改變。雖然，HPA亢進誘發抑郁樣行為的確切分子機制還不是很明確，但研究表明，HPA軸的調控與GR的一個伴侶蛋白FKBP5有關［9］。有文獻表明，攜帶高表達FKBP5基因純合子的人群易患抑郁癥［10］。基于以上信息，我們首先探討在慢性應激模型上FKBP5的病理變化，然后采用人工大量給予皮質酮（40 mg·kg－1）模擬HPA軸亢進的大鼠抑郁模型［6，11］，探討 FKBP5的表達異常是否受到糖皮質激素的誘導。

1 材料

1.1 實驗動物 健康Spargue-Dawley♂大鼠，體質量220～250 g，購自中國醫學科學院實驗動物中心［動物合格證號：SCXK（京）2011-0004］。SPF級飼養。

1.2 藥物與試劑 水合氯醛（國藥集團）；皮質酮ELISA試劑盒 （Kit category No：500655，Cayman）購自北京欣博盛生物技術有限公司；皮質酮（Sigma）購自北京惠比特生物科技有限公司；FKBP5抗體（Abcam，51 ku）、β-actin抗體（Sigma，42 ku）、辣根過氧化物酶標記羊抗兔二抗（Santa Cruz）均購自上海優寧維生物科技有限公司；甘氨酸（Amresco）；Tris（Amresco）；丙烯酰胺（國藥集團）。

1.3 儀器 超純水儀（Millipore）；超低溫冰箱（SANYO）；電子分析天平（Japan）；電動勻漿機（德國）；冷凍離心機（Sigma）；酶標儀（Thermo）；生物分子成像儀 （GE-LAS4000，美國）；曠場（76.5 cm×76.5 cm×40 cm，中國醫學科學院藥物所）；高架十字迷宮（中國醫學科學院藥物所）。

2 方法

2．1 CMS實驗方案 應激內容為：束縛4 h；濕墊料過夜；搖晃1 h（160 r·min－1）；禁食 12 h；冰水游泳4℃，10 min；飼養籠傾斜45°過夜；夾尾1 min；擁擠過夜（8只／籠）。白天使用兩種應激，夜晚使用一種應激，連續應激4周。

2.2 大劑量皮質酮造模 將皮質酮溶于橄欖油中，以40 mg·kg－1的劑量給大鼠皮下注射，每天1次，持續21 d造模。

2.3 行為學檢測

2.3.1 新奇覓食潛伏期實驗 實驗動物在進行24 h禁食后，將動物置于一個長×寬×高為76.5 cm×76.5 cm×40 cm的曠場中，曠場中間放有一定量的食物，動物從曠場的一角放入，觀察動物在5 min內成功覓食所花費的時間。同時試驗后測量動物在5 min內消耗的食物總重量，以此作為參考來判斷實驗動物饑餓程度是否一致［12］。

2.3.2 強迫游泳實驗 大鼠被放進一只裝有水的塑料桶（直徑20 cm，深80 cm），水溫為 23℃ ～25℃，水面離桶底為25 cm，游泳適應15 min。24 h后，大鼠再次放入裝有水的桶中，用照相機記錄大鼠5 min內的游泳情況。然后將大鼠用毛巾擦干放回籠中［13］。

2.3.3 糖水偏好實驗 在糖水檢測前用1%的糖水讓動物適應48 h，禁水4 h后將動物置于放有兩個相同水瓶的飼養籠中。這兩只水瓶一只盛有1%的糖水，另一只裝有自來水。記錄1 h內每只大鼠分別飲用糖水和自來水的體積。糖水偏好被定義為飲用的糖水體積占飲用糖水加自來水總體積的比例［14］。

2.3.4 高架十字迷宮 高架十字迷宮由4臂組成，兩只封閉臂的周圍由50 cm的高墻圍繞，臂寬10 cm，長50 cm，東西伸展。兩只開放臂周圍有0.5 cm高的邊緣圍繞，臂寬10 cm，長50 cm，南北伸展。4臂離地面高40 cm。實驗動物被放在迷宮的中間，鼻尖朝向其中一只封閉的臂。動物在迷宮中5 min內的活動由錄像機記錄。在每只大鼠實驗完畢后，用75%乙醇清洗迷宮［15］。

2.3.5 曠場實驗 將動物置于一個長×寬×高為76.5 cm×76.5 cm×40 cm的曠場中，動物從曠場的一角放入，觀察動物的水平運動情況和直立運動情況，檢測動物的自由活動能力和探索能力，分別記錄動物的跨格數目和直立次數［6］。

2.4 糖皮質激素含量測定 用眼眶采血收集血樣后，在離心機上以5 000轉的轉速離心5 min，收集上清測定皮質酮的含量。檢測方法采用ELISA試劑盒，操作步驟嚴格按照說明書進行。

2．5 Western blot檢測FKBP5蛋白的表達

2.5.1 蛋白樣品的制備 行為學結束后，大鼠斷頭取腦，分別分離海馬和前額葉皮質區。前額葉皮質區的分離參照腦區分布圖譜［16］，以前囟點為原點準確定位坐標是：前囟點往前2.2 mm～4.2 mm，左右分別旁開0.5 mm。分別取海馬和PFC的蛋白樣品適量，以1∶10的量加入蛋白裂解液（50 mmol·L－1Tris-HCl pH＝7.5，150 mmol·L－1NaCl，1‰SDS，1%Triton X-100，1%脫氧膽酸鈉，1 mmol·L－1EDTA，1 mmol·L－1PMSF）。蛋白濃度的測定使用蛋白定量分析試劑盒，確保每個蛋白樣品的上樣量一致。每120μl的蛋白加40μl的上樣緩沖液，在沸水中蛋白變性10 min，－20℃保存待用。

2.5.2 Western blot 配體積分數為12%的SDSPAGE分離膠，取35μg制備好的蛋白樣品進行上樣，待目的蛋白分開后停止電泳。100V恒壓轉移至PVDF膜，接著用含3%牛血清清蛋白的TBST（體積分數為 1‰Tween 20，0.1 mol·L－1NaCl，0.1 mol·L－1Tris-HCl pH＝7.5）室溫封閉 PVDF膜 2 h。隨后分別加入抗FKBP5（1∶1 000）或抗β-actin（1∶1 000）的一抗4℃孵育過夜。TBST洗膜3次，每次5 min。然后用同源的二抗室溫孵育2 h。TBST洗膜3次，每次10 min，將PVDF膜在生物分子成像儀中曝光。

2.6 統計學處理 數據以ˉx±s表示，采用SPSS 13.0軟件進行t檢驗分析。

3 結果

3．1 CMS后大鼠體內糖皮質激素水平 應激4周后，模型組大鼠體內糖皮質激素水平明顯高于對照組（Fig 1），差異具有統計學意義（P＜0.01）。提示我們在應激的過程中伴隨著糖皮質激素水平的升高。

Fig 1 Content of plasma corticosterone in both groups of rats（n＝5）**P＜0.01 vs control.

3．2 CMS對大鼠行為學的影響 大鼠在接受4周的應激后，在曠場實驗中，水平運動和直立運動次數明顯降低，說明模型組大鼠在曠場測試中自發活動減少（P均 ＜0.01；Fig 2a，2b）；在糖水實驗中，模型組大鼠糖水偏好明顯降低，表明了模型組大鼠明顯的興趣缺失傾向（P＜0.01；Fig 2c）；強迫游泳主要檢測的是動物在遇到應激時的無助絕望的情緒改變。模型組大鼠不動時間明顯高于對照組，表現了模型組大鼠遇到不可逃避的應激時的無助絕望的行為 （P＜0.01；Fig 2d）；覓食潛伏期和高架十字主要檢測的是大鼠焦慮樣行為，抑郁患者常常伴隨焦慮樣行為的發生。模型組大鼠的覓食潛伏期明顯高于對照組，在高架十字實驗中，停留在閉臂中的時間明顯增加，提示模型組大鼠出現了明顯的焦慮樣行為（P均 ＜0.01；Fig 2e，2f）。同時，大鼠在接受應激后，體重明顯下降（P＜0.01；Fig 2g）。

3．3 海馬和前額葉皮質（PFC）中FKBP5的表達水平 海馬和PFC區與抑郁發病機制密切相關，因此我們分別檢測了這兩個腦區內FKBP5的蛋白表達變化。結果顯示，應激后模型組大鼠海馬和PFC中FKBP5的表達水平明顯高于對照組（Fig 3），差異具有統計學意義（P均＜0.01）。

3.4 大劑量皮質酮注射對大鼠抑郁樣行為的影響大鼠皮下注射40 mg·kg－1的皮質酮21 d后，在糖水實驗中，模型組大鼠糖水偏好明顯下降，表現出抑郁樣行為（Fig 4），差異具有統計學意義（P＜0.05），表明大劑量糖皮質激素誘導的大鼠抑郁模型是成功的。

Fig 2 Rats show depressive-like and anxiety-like behaviors after exposure to CMS（ˉx±s，n＝12）

3．5 大劑量皮質酮注射對FKBP5表達的影響為了驗證FKBP5表達上調是否是由糖皮質激素誘導的，我們采用大鼠皮下注射40 mg·kg－1的皮質酮，連續注射21 d后，用Western blot分別檢測PFC區和海馬區FKBP5的表達情況。結果顯示，PFC區FKBP5表達明顯上調，差異具有統計學意義（P＜0.05；Fig 5），而海馬區FKBP5的表達無明顯變化，差異沒有統計學意義（P＞0.05）。提示我們FKBP5在PFC區的上調可能依賴于糖皮質激素水平的升高。

4 討論

長期的應激在抑郁癥的發病過程中起著重要的作用。慢性應激（CMS）模型是一個具有高度穩定性和可預測性的抑郁動物模型［17］。CMS被認為能夠模擬促進人類抑郁病情發展的應激生活事件，產生類似于臨床上抑郁病人的行為和內分泌改變［18］。在本實驗中我們采用慢性應激模型成功地模擬出了大鼠的興趣缺失、無助絕望和焦慮樣行為，并且檢測到應激后大鼠體內糖皮質激素水平升高。在大劑量的皮質酮注射21 d后，成功誘導出大鼠抑郁樣行為，即在糖水試驗中糖水偏好明顯降低。

Fig 3 Effect of CMSon expression of FKBP5 in PFC and hippocampus

Fig 4 Effect of CORT injection on rats’sucrose consumption in sucrose preference test（n＝10）

Fig 5 FKBP5 protein expression in hippocampus and PFC after repeated corticosterone injection for 21 days

分子水平上我們檢測到，經過CMS后海馬和PFC中FKBP5蛋白表達上調。FKBP5在調控HPA軸功能和GR活性方面起著重要的作用。FKBP5是hsp90的一個共伴侶蛋白，調控GR的敏感度。FKBP5的高表達會降低GR對糖皮質激素的敏感度，降低GR的入核效率。在人體FKBP5基因發生變異導致FKBP5過表達會影響GR的敏感度，降低HPA軸負反饋調節的效率，導致人體在遭受應激后長時間的糖皮質激素高分泌［19－20］。有文獻報道［21］，在抑郁患者前額葉皮質中發現 FKBP5的mRNA和蛋白都是高表達的。我們的實驗結果與這些發現一致，在CMS后，大鼠海馬和前額葉皮質區的FKBP5蛋白表達增加。并且在反復注射皮質酮21 d后，大鼠前額葉皮質中FKBP5表達增加，進一步說明前額葉皮質中FKBP5表達增加可能介導糖皮質激素的升高。但有趣的是，在大量給予皮質酮誘導的抑郁模型中，海馬區的FKBP5蛋白表達與空白組相比并未發生改變。原因可能是CMS誘導的抑郁樣病理模型機制錯綜復雜，它不僅涉及到糖皮質激素的大量分泌，還與神經遞質假說、內分泌假說和神經發生及突觸可塑性假說密切相關。另外，PFC區是調控大鼠情緒的腦區，在長期注射皮質酮和CMS模型上都可以出現大鼠情緒低落的抑郁樣行為，因此，不難解釋在PFC區出現FKBP5蛋白的高表達。

總之，我們的實驗結果表明，在CMS抑郁動物模型上同時存在HPA軸的亢進及FKBP5的高表達。并且在由大量皮質酮誘導的抑郁模型中PFC區FKBP5蛋白表達增加。提示FKBP5可能參與了糖皮質激素介導的抑郁樣行為的發生，其確切機制還需進一步研究。

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