異硫氰酸芐酯誘導腦膠質瘤U-87 MG細胞凋亡及其機制的研究

李文明，吳 琦，朱 彧

（1.北京紅惠新醫藥科技有限公司，北京 102600；2.天津市環湖醫院檢驗科，天津市腦血管與神經變性重點實驗室，天津 300060）

原發性腦腫瘤長在有限的顱腔空間中，對中樞神經系統造成傷害，極易危及生命。在原發性腦腫瘤中，膠質瘤最為常見，約占50%，而在惡性腦腫瘤中，腦膠質瘤的比例則高達80%［1］，預后較差，中位生存期不超過2年［2－3］，尋找新的有效的治療方法仍然是十分必要的。

異硫氰酸鹽是一類天然的小分子化合物，這類化合物普遍存在于十字花科植物如綠花椰菜，卷心菜和水芹菜中。到目前為止，已經報道了幾十種天然的或半合成的異硫氰酸鹽，以萊菔硫烷（sulforaphane，SFN）、苯乙基異硫氰酸酯（phenethyl isothiocyanate，PEITC）和異硫氰酸芐酯（BITC）具有較高的生理活性［4］。其中，BITC對腦膠質瘤這一惡性腫瘤的抑制作用的研究仍然較少，因此本研究著重探討BITC對人腦膠質瘤細胞系U-87 MG的抑制作用和其中的機制。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器 人腦膠質瘤U-87MG細胞系購自中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所；細胞培養基購自Gibco公司；BITC購自Sigma公司；MTS檢測試劑、real time-PCR檢測試劑盒購自Promega公司；細胞凋亡和細胞周期檢測試劑盒購自BD Biosciences；ROS檢測試劑盒購自碧云天生物技術研究所；單克隆檢測抗體購自Santa Cruz公司；轉錄因子轉錄活性報告基因檢測試劑盒購自Promega；ECL免疫印跡底物試劑盒購自Millipore公司；FACS Aria流式細胞儀購自BD公司；Multiskan Spectrum酶標儀和PikoReal PCR儀購自Thermo公司。

1.2 細胞及培養體系 U-87 MG細胞培養于含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培養基中，培養條件為37℃、5%CO2、飽和濕度，采用0.25%胰酶-EDTA消化傳代。

1．3 MTS法檢測BITC對腫瘤細胞增殖的抑制作用 取對數生長期的細胞配制為3×107·L－1的細胞懸液，100μl／孔接種到96孔微孔板中，培養過夜。向相應試驗孔分別加入 0、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50和100μmol·L－1的 BITC，繼續培養 72 h，吸去培養基，按照試劑盒說明書加入MTS試劑，培養2 h后，以酶標儀測定OD值（A490nm波長）。細胞增殖抑制率／%＝（1－BITC處理組OD值／對照組OD值）×100%，細胞達到50%抑制率時所對應的BITC濃度即為其IC50值。

1．4 流式細胞術檢測腫瘤細胞凋亡和ROS生成取對數生長期的腫瘤細胞接種于6孔板中，繼續培養24 h，為檢測BITC對腫瘤細胞凋亡的作用，分別加入 PBS或10、20μmol·L－1的 BITC到試驗孔中，繼續培養24 h，胰酶消化收集細胞，PI／Annexin V室溫避光染色15 min，用流式細胞儀檢測凋亡細胞。

取對數生長期的腫瘤細胞接種于6孔板中，繼續培養24 h，為檢測BITC對腫瘤細ROS的誘導作用，分別加入PBS或2和5μmol·L－1的BITC到試驗孔中，繼續培養24 h，胰酶消化收集細胞，DCFHDA室溫避光染色30 min，用流式細胞儀檢測細胞活性氧（ROS）產生。

1．5 Western blot法檢測腫瘤細胞凋亡相關基因的表達 取對數生長期的腫瘤細胞接種于6孔板中，繼續培養24 h，分別加入PBS或2和5μmol·L－1的BITC到試驗孔中，繼續培養24 h，消化、離心、收集、裂解細胞后提取細胞總蛋白。以BCA法測定細胞裂解液中的總蛋白含量，取100μg總蛋白以12%SDS-PAGE分離后，轉移至PVDF膜上。5%脫脂牛奶室溫封閉1h后，洗滌3次，加入單克隆抗體（Bcl-2，1∶500；Survivin，1∶500；caspase-3，1∶400；caspase-8，1∶400；p-JNK，1∶400；β-actin，1∶5 000）室溫孵育4 h，洗滌3次，以HRP連接的二抗室溫孵育2 h，洗滌3次，以ECL試劑盒顯示免疫反應條帶。β-actin作為蛋白加樣內參照。

1．6 Real time-PCR檢測腫瘤細胞凋亡相關基因的mRNA表達 取對數生長期的腫瘤細胞接種于6孔板中，繼續培養24 h，分別加入PBS或2和5 μmol·L－1的 BITC到試驗孔中，繼續培養 24 h，用TRIzol法提取各組總RNA，用Real time PCR試劑盒進行逆轉錄得到 cDNA。Bcl-2上游引物序列：5′-ACGGGGTGAACTGGGGGAGGA-3′，下游引物序列：5′-TGTTTGGGGCAGGCATGTTGACTT-3′；Survivin上游 引 物 序 列：5′-CTCTACATTCAAGAACTGGCC-3′，下游引物序列：5′-TTGGCTCTTTCTCTGTCCAG-3′；β-actin上游引物序列：5′-TGAGCGCGGCTACAGCTT-3′，下 游 引 物 序 列： 5′-TCCTTAATGTCACGCACGATTT-3′；94℃變性3 min后，按下述條件擴增40個循環：95℃ 5 s，65℃ 35 s，72℃ 60 s，循環后72℃延伸5 min。

1.7 轉錄因子核轉錄活性檢測 取對數生長期的腫瘤細胞接種于6孔板中培養24 h，轉染AP-1熒光報告質粒，繼續培養6 h，更換新鮮培養基，分別加入PBS或2和5μmol·L－1的BITC到試驗孔中，繼續培養24 h，然后根據試劑說明書的方法，檢測AP-1的轉錄活性。

1.8 統計學處理 計量資料以ˉx±s表示，采用SPSS 13.0軟件進行單因素方差分析（One-way ANOVA）。

2 結果

2．1 BITC可明顯抑制U-87 MG的體外生長 用MTS方法評價BITC作用72h對U-87MG體外生長的抑制作用，從試驗結果看，BITC具有明顯的抑制作用，3次重復試驗測得 IC50均值為（15.2±1.2）μmol·L－1，見 Fig 1。

Fig 1 Inhibitory effect of BITC on the U87MG cell line proliferation（ˉx±s，n＝6）

Fig 2 Effect of BITC on the apoptosis-induced ROS expression in U87MG cell line（Bars indicate SD，n＝3）

2．2 BITC明顯地促進細胞凋亡和ROS產生 為研究BITC對細胞凋亡的作用，我們選取10和20 μmol·L－1BITC進行研究，10和 20μmol·L－1BITC作用24 h后凋亡率分別為29.3%和68.6%（P＜0.05）。2和5μmol·L－1BITC作用腫瘤細胞24 h后，抑制率為3.8%和11.6%，分別為無毒（抑制率＜5%）和低毒（抑制率＜15%）濃度，我們采用上述兩種濃度進行后續研究，以排除細胞增殖抑制對結果的影響。2和5μmol·L－1BITC作用腫瘤細胞24 h后，ROS產生分別為對照組的3.76倍和6.07倍（P＜0.05），表明 BITC介導腫瘤細胞凋亡的作用可能與其誘發細胞氧化損失有關，見Fig 2。

2．3 BITC調節凋亡相關蛋白 Bcl-2、Survivin、caspase-3和caspase-8表達 為進一步研究BITC誘導細胞凋亡的機制，我們檢測了凋亡相關蛋白表達的變化。結果顯示，經BITC誘導凋亡的細胞，其促凋亡蛋白caspase-3和caspase-8的水平均明顯上升，抑凋亡蛋白Bcl-2和Survivin明顯下降（Fig 3），2和5μmol·L－1的 BITC作用24 h后，Bcl-2 mRNA表達分別是對照組的32.7%和19.2%（P＜0.05），Survivin mRNA表達分別是對照組的41.3%和22.7%（P＜0.05）。

2．4 BITC可促進JNK磷酸化和抑制AP-1轉錄活性 為了考察BITC誘導腫瘤細胞凋亡的信號通路，我們研究了BITC對一些關鍵信號通路上的關鍵蛋白的作用。研究發現，BITC促進了與細胞凋亡緊密相關的JNK蛋白磷酸化（Fig 4）和AP-1轉錄活性，2和5μmol·L－1的 BITC作用24 h后，AP-1轉錄活性分別是對照組的42.5%和26.7%（P＜0.05）。

Fig 3 Effect of BITC on apoptosis related gene expression in U87MG cell line

Fig 4 Effect of BITC on phosphorylation of JNK of U87MG cell line

3 討論

腦膠質瘤是最常見的惡性腦部原發性腫瘤，化療是其常用的治療方法之一，因此尋找有效的藥物是膠質瘤研究的重點［5－6］。經研究發現，十字花科植物中的異硫氰酸酯可以降低癌癥的患病率，其中BITC是活性較高的異硫氰酸酯之一，然而BITC對腦膠質瘤的作用還未得到充分研究。

Pro-caspase-8可被激活轉變為活化的caspase-8，經caspase的級聯反應激活下游的效應caspase-3，導致細胞凋亡。Survivin是重要的凋亡抑制蛋白，研究表明其可通過直接抑制凋亡終末效應酶caspase-3活性來阻斷細胞凋亡過程［7］。Bcl-2可通過改變線粒體巰基的氧化還原狀態，降低胞內的氧化還原電位抑制細胞凋亡［8－9］。

在本研究中，我們發現BITC可抑制U-87MG細胞體外增殖，其 IC50為15.2μmol·L－1。為了進一步探討BITC抑制腫瘤生長的機制，我們考察了BITC對腫瘤細胞凋亡的誘導作用。結果發現，在較高濃度下（10和20μmol·L－1）BITC可明顯促進細胞凋亡。為了消除細胞凋亡對后續試驗的影響，我們采用無毒濃度（細胞抑制率＜5%）和低毒濃度（細胞抑制率＜15%）繼續探討BITC對腫瘤細胞凋亡的作用機制，我們發現在2（無毒濃度）和5μmol·L－1（低毒濃度）BITC作用下，BITC可抑制 Survivin表達，上調其下游的caspase-3和caspase-8表達。同時，我們發現BITC可使U-87 MG細胞內的ROS水平明顯上升，同時抑制Bcl-2表達，說明氧化損傷在BITC誘導凋亡中發揮重要作用，與文獻報道相一致［10］。

JNK是MAPK通路重要的信號分子，被認為與惡性腫瘤的發生發展具有密切聯系，可作為多種惡性腫瘤的分子治療靶點。JNK被磷酸化激活后可進入細胞核，抑制轉錄因子AP-1，調控下游凋亡相關靶基因的轉錄和表達，或者通過直接調節Bcl-2轉錄和表達，影響細胞凋亡。同時，也有報道認為ROS可直接激活JNK活性，進而誘導細胞凋亡［11］。在對信號通路的研究中，我們發現BITC可上調JNK活性，下調AP-1活性。這與JNK和AP-1活性的改變可抑制腫瘤細胞增殖，誘導細胞凋亡的報道相一致，可能是BITC抑制腫瘤生長，誘導腫瘤細胞凋亡的機制之一。

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