富含脯氨酸的酪氨酸激酶2生物功能及藥物研究進展

張 釗，楚世峰，陳乃宏

（天然藥物活性物質與功能國家重點實驗室，中國醫學科學院北京協和醫學院藥物研究所，北京 100050）

富含脯氨酸的酪氨酸激酶2（proline-rich tyrosine kinase 2，Pyk2）又稱 CAKβ（cell adhesion kinase beta）、RAFTK（related adhesion focal tyrosine kinase）、FAK2（focal adhesion kinase 2），是粘著斑激酶FAK家族重要成員之一。已有研究表明Pyk2在腫瘤遷移、免疫系統疾病及骨代謝等方面都有重要作用，了解其分布、結構及調控機制將為我們更好地進行藥物設計及疾病治療提供理論依據。

1 Pyk2的分布

人Pyk2基因定位于8號染色體上（8p21.1），與FAK含有相似的結構域，其分子序列上的同源率約為45%，而中心激酶區結構域同源率高達60%。Pyk2主要分布于中樞神經系統及造血系統，在小腸、腎、脾及睪丸中也有表達。大鼠腦組織中Pyk2在海馬、大腦皮層及嗅球中選擇性高表達；腎臟中Pyk2蛋白主要位于近端小管細胞。除Pyk2全長外，Pyk2還存在兩種剪切異構體。相比全長，一個在C末端的兩個富含脯氨酸的序列中缺失了一段表達42個氨基酸的外顯子，稱為Pyk2s（Pyk2 splice form）；另一個僅編碼Pyk2 C末端結構域的一部分，被命名為PRNK（Pyk2-related non-kinase）。Pyk2全長主要位于腦中，而剪切體Pyk2s及PRNK主要在脾中表達，腦組織表達較低。研究表明Pyk2的功能多樣性可能與其剪切異構體相關。

2 Pyk2的結構域

Pyk2的功能性結構域包括N-端FERM結構域、中心激酶結構域、富含脯氨酸結構域、C-端FAT結構域。具體結構及功能如下：

2.1 FERM結構域 Pyk2的 N-端為 FERM（protein4.1-ezrin-radixin-moesin）結構域，編碼330個氨基酸。FERM結構域形似壓縮的三葉草，含有3個模體（分別命名為F1，F2和F3），能夠介導蛋白與蛋白以及蛋白與膜之間的相互作用。磷脂酰肌醇二磷酸（PIP2）結合在F1和F3之間的縫隙中，誘導Pyk2構象改變，暴露出FERM蛋白序列，導致其與跨膜蛋白胞內尾段結合［1］。FERM結構域突變抑制Pyk2的磷酸化，可能與FERM介導的蛋白相互作用或Pyk2胞內分布的改變有關。最近研究發現哺乳動物Ste20同源物MAP4K4與Pyk2 FERM結構域特異性結合，促進膠質瘤細胞遷移。提示抑制MAP4K4與Pyk2 FERM結構域的結合可能為控制膠質母細胞瘤擴散提供新的治療策略［2］。

2.2 中心激酶結構域 FERM結構域通過一段約40個氨基酸的短肽與Pyk2中心激酶結構域相連，此連接短肽的377-380位殘基為一個Pro-X-X-Pro模體，402位為酪氨酸自磷酸化位點（Tyr402）。激酶結構域為雙葉型結構，其Tyr402磷酸化可為含SH2結構的蛋白（如Src和p85）提供結合位點，Src的結合導致Pyk2的Tyr579及Tyr580位點磷酸化，從而激發Pyk2最大的激酶活性。Pyk2激酶結構域與FAK催化結構域的同源率為60%，且與其他蛋白酪氨酸激酶也表現出高同源性。而Pyk2特有的Asp-Phe-Gly（DFG）模體可激活回路，其構型上的特異性使其成為選擇性激酶抑制劑的靶點［3］。

2.3 富含脯氨酸結構域 Pyk2兩個富含脯氨酸的序列（713Pro-Pro-Pro-Lys-Pro-Ser-Arg-Pro720和855Pro-Pro-Gln-Lys-Pro-Pro-Arg-Leu862）位于激酶結構域之后，能介導Pyk2和一些含有SH3結構的蛋白（包括p130Cas、ASAP1、PSGAP、Graf等）相互作用。Aoto等［4］研究發現Pyk2第2個富含脯氨酸的結構域突變可引起其核定位的增多，繼而引發Hic-5聚集，提示Pyk2可能在轉錄調控中也發揮重要作用。

2.4 FAT結構域 Pyk2 C-端的黏附結構域（FAT）可使Pyk2定位于局部黏附部位。Pyk2的FAT結構域為反向平行的四螺旋體結構［5］，可以介導Pyk2與paxillin以及凝膠溶素C-端的LD模體相互作用，進而影響Pyk2對肌動蛋白骨架重組的調控［6］。FAT結構域內含有Tyr881位點，其被Src磷酸化后可成為Grb2銜接子結合位點，進而調控MAPK信號通路［7］。

3 Pyk2的主要功能

3.1 Pyk2對免疫系統的影響 Pyk2在免疫細胞尤其是巨噬細胞及B細胞的生物學功能方面起重要作用。Okigaki等［8］發現同源重組敲除Pyk2后產生的小鼠不僅能夠存活，而且可生育且無表型異常。而Pyk2-／-小鼠T細胞、B細胞、NK細胞、巨噬細胞等的分布卻發生了明顯的變化，表現為Pyk2-／-小鼠來源的B細胞運動活性及對細胞因子的反應性明顯降低［9］。在細胞因子的刺激下，Pyk2-／-小鼠的巨噬細胞前端板狀偽足的形成明顯延遲，并且尾端不能從基質黏附中撤離，從而導致其遷移能力的急劇下降。進一步研究發現無論有無細胞因子存在，與野生型巨噬細胞相比，這些巨噬細胞伸展能力都明顯增加，形成更大的無方向性的板狀偽足。Pyk2回復后遷移表型也得到了恢復，且在Pyk2-／-的巨噬細胞中未能檢測到FAK過表達。在細胞因子的刺激下，Pyk2-／-小鼠分離的巨噬細胞前端的板狀偽足中并未發現F-actin的富集，而是在膜上發現許多定位不同及方向不定的膜褶皺。以上研究表明趨化刺激下Pyk2在骨架成分重組及運動極性的形成中起了重要作用。

3.2 Pyk2在腫瘤中的作用 大量研究表明過表達Pyk2不僅能夠促進腫瘤細胞增殖，而且可促進腫瘤細胞的遷移。Lim等［10］研究發現 Pyk2的 FERM結構域能夠促進依賴Mdm2的p53泛素化降解，促進細胞以不依賴激酶的方式生長，而敲除Pyk2可增加p53水平，將細胞阻滯于G1期從而抑制細胞增殖。Pyk2在惡化的乳腺癌細胞中表達明顯增多，在早期導管原位癌（DCIS）及侵襲性乳腺癌中與ErbB-2共同高表達［11］。早期研究發現肝癌細胞中Pyk2的過表達與其轉移能力增強及存活率減少有關［12-13］。近期 Liu等［14］進一步研究發現肝癌發展中伴隨著miR-517a及 miR-517c的表達下調，Pyk2作為miR-517a及 miR-517c的靶蛋白可以解除其對G2／M轉化的抑制，進而促進肝癌的發生和發展。非小細胞肺癌中Pyk2的表達量也明顯升高，并與其遷移能力成正比［15-16］。此外，神經膠質細胞瘤中Pyk2的表達量也呈現明顯的升高［17］。Loftus等［18］研究發現 Pyk2具有促進神經膠質瘤細胞遷移和侵襲的功能，并證明FERM結構域在Pyk2促進神經膠質瘤細胞遷移中起重要作用，可作為抑制神經膠質細胞遷移的靶點。近期研究發現Pyk2表達上調能夠通過Wnt／β-Catenin途徑，使多發性骨髓瘤（MM）細胞穩定黏附于骨髓源基質細胞（BMSCs），導致多發性骨髓瘤細胞產生對硼替佐米（bortezomib）的耐藥性［19］。最新統計數據表明伊馬替尼（imatinib）雖然是目前治療慢性粒細胞白血病（CML）的一線藥物，卻能大大增加CML病人的髓外復發（EMR）機率。Ovcharenko等［20］對其機制進行了研究，發現伊馬替尼作用于CML細胞系K562后，可使Pyk2 mRNA及蛋白表達水平出現明顯上調，從而增強K562黏附、遷移及侵襲能力；同樣的現象在全反式維甲酸處理的急性早幼粒細胞白血病（APL）細胞系NB4中也可以觀察到，提示Pyk2靶向抑制可以有效降低CML及APL髓外復發機率。

3.3 Pyk2對骨代謝的影響 正常情況下，成骨細胞與破骨細胞處于平衡狀態。骨質疏松患者體內成骨細胞及破骨細胞的平衡被打破，破骨細胞過度活化，骨吸收增加。Buckbinder等［21］發現Pyk2為骨細胞分化抑制子，前成骨細胞在Pyk2敲除小鼠中的分化和活性增加，促使骨生成進而增加骨量。Pyk2在成骨細胞和破骨細胞中都有表達，成骨細胞中敲除Pyk2影響其分化、遷移及肌動蛋白的骨架重組，影響局部黏附的回復［21-22］。破骨細胞中，Pyk2定位于偽足小體周邊，敲除Pyk2結構形成無序的偽足小體［23］，并導致破骨細胞骨重吸收能力的降低，進而導致骨硬化［21，23］。已有研究表明Pyk2參與αvβ3整合素介導的信號途徑，在調控破骨細胞功能中起重要作用，體內體外實驗表明抑制αvβ3整合素可以抑制骨吸收［24］，推測針對Pyk2的調控可能對骨科疾病如骨質疏松、牙周病等疾病的發展產生影響。近期研究發現Pyk2-／-小鼠補充少量雌二醇可明顯增加其骨容量，提示雌二醇聯合Pyk2靶向干預有望成為絕經后骨質疏松癥的新療法。

Tab 1 Drug development targeting Pyk2

4 Pyk2與FAK同源性及功能差異

如前所述，Pyk2與FAK不僅具有高度序列同源性，還具有許多相似的生物學功能。Weis等［25］研究FAK在成年小鼠內皮細胞血管生成中的作用時發現，敲除FAK會引起Pyk2表達量代償性的升高。在FAK缺失的情況下，Pyk2可代償性地激活整合素依賴的信號傳導通路。上述結果提示，在血管生成過程中，FAK與Pyk2兩者具有相互代償的能力。

雖然Pyk2與FAK具有高度的同源性，二者之間也存在著明顯的區別。相比Pyk2集中于中樞神經系統及造血系統高表達，FAK在各組織均普遍存在；Pyk2的激活也與FAK有一定的區別，FAK主要被整合素介導的胞外基質黏附所激活，而Pyk2雖然能被整合素介導的黏附激活，但其主要對能引起胞內Ca2+升高的各種刺激起反應［26］。此外，Lipinskin等［27］研究發現Pyk2及FAK在惡性膠質瘤遷移及增殖中的作用不同，FAK過表達抑制細胞遷移，促進細胞增殖；與之相反的是Pyk2過表達促進細胞遷移，抑制細胞增殖，表明兩者在腫瘤增殖和遷移的發生發展過程中依賴于不同的調控機制。

5 以Pyk2為靶點的新藥研發進展

實驗表明，FERM結構域在調控Pyk2的活性中起重要作用。Pyk2 FERM結構域的單克隆抗體12A10能特異性識別并結合于FERM結構域F3模體的β5C-α1C表面，覆蓋了在Pyk2活性中起重要作用的位點，從而抑制其活性。同時12A10也被證明具有Pyk2特異性，不能與FAK的FERM結構域結合。生物學功能研究表明12A10可劑量依賴性的抑制神經膠質瘤細胞的遷移［18］。采用Pyk2 FERM結構域的三維結構篩選其小分子抑制劑，篩選得到的化合物不僅能夠特異性結合Pyk2的FERM結構域，而且可抑制FERM結構域與12A10單克隆抗體的結合。生物學實驗表明它們也可以有效地抑制Pyk2介導的神經膠質細胞的遷移。此工作證明FERM結構域可以作為抑制Pyk2活性的激酶區外新型靶位，有效的靶向蛋白-蛋白相互作用以調控Pyk2激酶活性進而調控細胞遷移等功能。表1所示為目前以Pyk2為靶點的藥物研發進展［28-29］。

6 結語

本文從Pyk2的結構域、相關功能、靶位及其在免疫系統、腫瘤增殖遷移、骨發育中的作用進行了詳細的闡釋，表明Pyk2主要通過影響骨架蛋白等的相互作用對腫瘤發生發展，骨及免疫細胞等的分化遷移發揮調控作用。對其功能的詳細了解為其治療侵襲性癌癥，骨質疏松癥及炎癥細胞反應，依此設計合理的藥物及指導臨床治療方案提供了理論依據。

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