分泌型簇蛋白在肺動脈高壓大鼠中的表達變化

劉曉艷，孟劉坤，李 君，魏英杰

（1.首都醫科大學附屬北京朝陽醫院醫學研究中心，北京 100020；2.中國醫學科學院北京協和醫學院國家心血管病中心阜外心血管病醫院心血管疾病國家重點實驗室，北京 100037）

肺動脈高壓（pulmonary arterial hypertension，PAH）是以肺血管阻力持續增加為特征的臨床-病理綜合征，臨床表現為右心室后負荷增加，活動耐力下降，嚴重者可發生右心衰竭而死亡，是最嚴重的具有潛在致命性的慢性肺循環疾病，已成為當今重要的國際性醫療保健問題［1］。肺血管重構是PAH的主要病理改變，表現為肌性動脈肌層增加，無肌性動脈出現肌層及新生內膜和叢狀病變的形成。其中，肺血管壁細胞的過度生長在肺血管重構中發揮著重要的作用［2］。

分泌型簇蛋白（secretory clusterin，sCLU）是一種細胞保護性因子，具有促進細胞生長的作用，因此我們推測它可能參與了肺血管重構的過程［3］。本研究旨在闡明sCLU在MCT誘導PAH大鼠肺組織和血漿中的表達變化，為進一步探討肺血管重構的機制及尋找PAH新的生物標志物打下基礎。

1 材料與方法

1.1 試劑 MCT（Sigma公司），TRIzol（Invitrogen公司），AMV逆轉錄試劑盒（Promega公司），PCR引物（TaKaRa生物工程有限公司），抗 sCLU抗體（Millipore公司），抗 GAPDH抗體（Sigma公司），辣根過氧化物酶標記的抗小鼠二抗（北京中杉金橋生物科技有限公司），BCA蛋白定量試劑盒（北京普利萊基因技術公司），大鼠sCLU酶聯免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測試劑盒（R＆D公司），Power SYBR green PCR master mix（ABI公司）。

1.2 動物模型制備及標本留取 30只SPF級♂SD（Sprague-Dawley）大鼠，體質量260～300 g（8周齡），隨機分為對照組（CON，n＝6）和MCT組（n＝24）。MCT組給予腹腔注射MCT 60 mg·kg-1，對照組給予等體積生理鹽水注射。分別在注射MCT后的1（n＝6）、2（n＝6）、3（n＝6）、4（n＝6）周用右心導管法檢測肺血流動力學指標（右心室收縮壓、肺動脈收縮壓、平均肺動脈壓）并計算右室肥厚指數：［右心室游離壁／（左心室+室間隔）］，以評估PAH的程度；收取動物的肺組織，一部分迅速存放于液氮中，準備用于Western blot和PCR檢測，余下部分用中性福爾馬林固定后石蠟包埋制成蠟塊，準備用于免疫組織化學（immunohitochemistry，IHC）檢測；同時留取動物的血漿標本，分裝后存于-80℃，準備用于ELISA檢測。

1.3 實時熒光定量聚合酶鏈式反應（real time PCR，RT-PCR） 取肺組織約100 mg，采用TRIzol法提取總RNA，逆轉錄為cDNA，RT-PCR檢測sCLU mRNA水平的表達變化［4］。引物序列如下：sCLU：5′-CCACAGGATGCCTGAAGATGAA-3′，5′-AGGTTA GCCTGGGCAGGATTG-3′；GAPDH：5′-GGCACAGTC AAGGCTGAGAATG-3′，5′-ATGGTGGTGAAGACGCC AGTA-3′。

1.4 Western blot 提取肺組織總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，各樣本取50μg總蛋白，100℃加熱5 min變性，4%～12%的預制膠電泳分離蛋白質；經半干轉的方式將蛋白轉移至硝酸纖維素膜上，用50 g·L-1的脫脂奶粉封閉1 h，4℃搖床孵育過夜；洗膜緩沖液（tris-buffered-saline with Tween，TBST）漂洗后接二抗，室溫孵育1 h；TBST再次漂洗后，化學顯色。一抗濃度分別為抗sCLU 1∶1 000，抗GAPDH 1∶2 000；二抗濃度為1∶2 000。

1.5 IHC 取制作好的蠟塊，切片，貼片后以磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）洗3次，每次5 min，高壓抗原修復；以體積分數為0.003的Triton X 100孵育20 min以破細胞膜；山羊血清封閉1 h后加入抗sCLU一抗（1∶400），4℃孵育24 h；PBS洗3次，每次5 min，加入辣根過氧化物酶標記二抗（1∶500），室溫孵育2 h；PBS洗 3次，每次 5 min，加入ABC復合物，室溫孵育2 h；PBS洗3次，每次5 min，用蒸餾水迅速沖3次；加入顯色液（DAB-H2O2），進行IHC顯色，控制好顯色時間，一般不超過30 min，PBS終止顯色；梯度酒精脫水，封片，拍照。

1.6 ELISA 大鼠血漿中sCLU濃度的檢測使用R＆D公司的試劑盒，按照說明書中操作步驟進行，試驗重復3次。

1.7 統計學分析 實驗數據用SPSS 17.0軟件進行統計分析，實驗結果以ˉx±s表示。多組間比較采用單因素方差分析，其中兩兩比較采用student’s t檢驗。

Fig 1 Changes of haemodynamics and right ventricular hypertrophic index±s，n＝6）RVSP：Right ventricular systolic pressure；PASP：Pulmonary arterial systolic pressure；mPAP：Mean pulmonary arterial pressure；RVHI：Right ventricular hypertrophic index.**P＜0.01 vs control group.

2 結果

2.1 動物模型PAH程度的評價 MCT組大鼠的右室收縮壓、肺動脈收縮壓、平均肺動脈壓和右室肥厚指數均較對照組大鼠明顯升高，并隨MCT注射時間的延長而逐漸升高（Fig 1），說明在此動物模型中形成了PAH的疾病狀態，并且PAH的程度隨時間延長而逐漸進展。

2.2 sCLU的mRNA在PAH大鼠肺組織中的表達變化 RT-PCR的結果顯示，與對照組相比，sCLU的mRNA在MCT誘導PAH大鼠肺組織中呈時間依賴性地升高，即注射MCT后2周時開始明顯升高，為對照組的2.1倍，4周時達到最高，為對照組的3.1倍（Fig 2）。

Fig 2 Changes of sCLU mRNA in MCT induced PAH rat lungs（xˉ±s，n＝6）**P＜0.01 vs control group.

2.3 sCLU的蛋白水平在PAH大鼠肺組織中的表達變化 Western blot的結果顯示，sCLU的蛋白水平在MCT誘導PAH大鼠肺組織中的表達變化與其mRNA水平變化趨勢一致，即隨PAH的進展而逐漸升高，注射MCT后2周時開始升高，為對照組的1.6倍，4周時最高，為對照組的2.6倍（Fig 3）。

Fig 3 Changes of sCLU protein in MCT induced PAH rat lungs（±s，n＝6）**P＜0.01 vs control group.

2.4 sCLU在PAH大鼠肺動脈中的定位情況IHC染色的結果顯示，sCLU在正常大鼠的肺小動脈中幾乎不表達，而在MCT處理組大鼠發生了重構的肺小動脈中表達明顯升高，并且sCLU主要定位于肺小動脈的胞質及細胞外基質中（Fig 4）。

2.5 sCLU在PAH大鼠血漿中濃度的變化 ELISA檢測的結果顯示，sCLU在大鼠血漿中的濃度亦隨注射MCT時間的延長而逐漸升高，與肺組織中sCLU mRNA和蛋白水平的表達變化相一致（Fig 5）。

Fig 5 Changes of sCLU plasma concentration in MCT induced PAH（±s，n＝6）**P＜0.01 vs control group.

2.6 sCLU的血漿濃度與肺血流動力學指標及右室肥厚指數的相關性 Spearman相關性分析顯示，sCLU的血漿濃度與右室收縮壓（r2＝0.537，P＜0.05），肺動脈收縮壓（r2＝0.621 2，P＜0.05），平均肺動脈壓（r2＝0.505 8，P＜0.05）及 右室肥厚指數（r2＝0.633 7，P＜0.05）均呈正相關（Fig 6）。這說明，血漿中sCLU的濃度與PAH的嚴重程度呈正相關，提示sCLU有可能是反映PAH嚴重程度的生物標志物（Fig 6）。

Fig 6 Correlation of sCLU plasma concentration with pulmonary haemodynamics index and right ventricular hypertrophic indexRVSP：right ventricular systolic pressure；PASP：pulmonary arterial systolic pressure，mPAP：mean pulmonary arterial pressure；RVHI：right ventricular hypertrophic index.

3 討論

簇蛋白（clusterin，CLU）是一種普遍存在于哺乳動物組織和體液中的異二聚體硫化糖蛋白，曾被稱為載脂蛋白 J（apolipoprotein J，Apo J）、硫化糖蛋白-2（sulfatedglycoprotein-2）等［3］。CLU的基因經轉錄后剪接形成兩個轉錄本，這兩個轉錄本經翻譯后分別形成分泌型CLU（secretory clusterin，sCLU）和核型 CLU（nuclear clusterin，nCLU）［5-6］。研究表明sCLU在細胞受到各種刺激時產生，具有促進細胞增殖和抵抗細胞凋亡的作用，是一種細胞保護性因子。而nCLU的功能與sCLU相反，主要發揮促進細胞凋亡的作用。基于PAH肺血管重構過程中肺血管壁細胞過度生長的特點與sCLU的功能相吻合，我們推測，sCLU可能在PAH大鼠的肺組織和血漿中的表達發生了變化，并參與了肺血管重構的過程。

MCT誘導的PAH大鼠模型是目前PAH研究中應用最多的模型之一，并且基于此模型發現了PAH的眾多細胞分子機制，是一種可信賴的PAH動物模型［7-10］。我們的結果表明，在注射MCT后大鼠的肺血流動力學指標和右室肥厚指數均呈時間依賴性地明顯升高，表明本研究中此模型構建得非常成功。在此模型基礎上，我們探討了sCLU在MCT誘導PAH大鼠肺組織和血漿中的表達變化。

本研究結果顯示，sCLU的mRNA和蛋白水平在MCT誘導PAH大鼠肺組織中明顯升高，呈時間依賴性，并且sCLU主要定位于發生了重構的肺小動脈管壁細胞胞質及細胞外基質中。這提示我們，sCLU可能在肺血管重構過程中發揮著重要的作用。基于sCLU的細胞保護性作用，我們推測它可能是通過促進肺血管壁細胞的增殖和凋亡抵抗來參與肺血管重構的，但是其確切的機制尚需進一步的研究。

ELISA的結果表明，sCLU的血漿濃度在MCT誘導PAH大鼠中亦隨注射MCT時間的延長而逐漸升高，并且與肺血流動力學指標和右室肥厚指數均呈正相關，這表明，sCLU可能是反映PAH嚴重程度的生物標志物。當然，此假設尚需在PAH病人中進行大規模的臨床驗證。

總之，本研究證明sCLU在MCT誘導PAH大鼠肺組織和血漿中的表達隨PAH的進展而逐漸升高，它可能通過促進肺血管壁細胞的生長而參與了肺血管重構的過程，此外，sCLU可能是反映PAH嚴重程度的生物標志物。

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