葫蘆素E抑制HeLa細胞mTORC1的活性并誘導細胞自噬

張曉鈺，徐麗慧，趙高翔，潘 浩，周 單，歐陽東云，何賢輝

（暨南大學生命科學技術學院1.免疫生物學系、2.細胞生物學系，廣東廣州 510632）

葫蘆素E（cucurbitacin E，CuE）是從葫蘆科植物中提取的一種四環三萜類化合物［1］，是葫蘆素家族的一個成員。研究表明［2-3］，CuE具有抗腫瘤、抗病毒、抗炎等多種藥理作用。細胞自噬是一種在真核細胞中高度保守的自我消化過程，自噬過程中，自噬體與溶酶體結合形成自噬溶酶體，降解細胞中多余或受損的大分子和細胞器，循環利用降解產物，從而維持細胞的內穩態［4］。我們發現，同屬葫蘆素家族的葫蘆素B在Jurkat細胞中誘導保護性自噬［5］，然而其誘導自噬的機制并未闡明。Zhang等［6］報道葫蘆素B和I通過線粒體來源的ROS而誘導自噬，這種作用與其誘導MAPK信號通路的活化有關，但不依賴STAT3信號通路。以往的研究證實了葫蘆素B在人A357和B16F10黑素瘤細胞中并不能提升ROS水平［7］，說明葫蘆素B誘導細胞自噬可能存在其他機制。Lee等［8］發現，葫蘆素B能抑制mTOR（mechanistic target of rapamycin）活性。mTOR是一種非典型的絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶，調控蛋白質、核糖體生成和能量代謝等多種生理功能，在控制細胞生長和代謝方面發揮關鍵的調控作用［9］。mTOR結合不同的組分后形成兩種獨特的復合體：mTORC1和 mTORC2。mTORC1參與調節自噬過程，許多細胞信號匯集到mTORC1調節細胞自噬的上游機制。在mTOR信號通路中，抑制mTOR活性促進細胞自噬［9-10］。作為葫蘆素B的類似物，CuE是否能夠抑制mTOR的活性，從而誘導細胞自噬，目前尚不清楚。本研究以HeLa細胞為模型，分析CuE對mTORC1活性的影響與其誘導細胞自噬的相關性，探討CuE誘導細胞自噬的作用機制，為進一步研究CuE的抗腫瘤和抗炎作用機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 細胞株和主要試劑 HeLa和MCF7細胞購自中國科學院上海細胞庫；高糖型DMEM、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、青霉素和鏈霉素為 Gib-co／Invitrogen產品；葫蘆素E（純度98%）購自上海順勃生物工程技術有限公司；氯喹（CQ）、二甲基亞砜（dimethylsulfoxide，DMSO）、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）購自 Sigma-Aldrich；WST-1試劑為Roche公司產品；RIPA裂解液（RIPA lysis buffer）和BeyoECL Plus化學發光試劑盒購自碧云天公司；所有免疫印跡抗體均購自Cell Signaling Technology公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 HeLa和MCF7細胞均用含有10%FBS、100 kU·L-1青霉素和 100 mg·L-1鏈霉素的DMEM培養基培養，置于37℃、5%CO2濕度飽和的培養箱中，每2～3 d換液傳代。取對數生長期的細胞用于實驗。

1.2.2 細胞增殖測定 WST-1法檢測細胞增殖。取對數期細胞，接種于96孔培養板內，每孔3 300個細胞，24 h后將培養液換成含藥物的新鮮培養液。分別培養24 h和48 h后，加入10μl WST-1試劑，37℃孵育0～4 h，每隔30 min用酶標儀在450 nm波長下測量吸光值（A450nm），參考波長為630 nm。空白組只含有培養基而無細胞，增殖率／%＝（實驗組A450nm-空白A450nm）／（對照組A450nm-空白A450nm）×100%。每個濃度點做3個復孔。通過GraphPad Prism 4.0軟件繪制細胞增殖活性曲線，并算出半數抑制濃度（IC50）值。

1.2.3 免疫印跡分析 參照前文［11］報道方法進行，簡述如下：將HeLa細胞接種于培養瓶中，24 h后加入相應的藥物和新鮮培養液，處理所需時間后，用冷PBS清洗，再用RIPA裂解液裂解細胞，離心后收集上清，取等量總蛋白上樣進行SDS-PAGE電泳。電泳結束后，將分離的蛋白轉移到PVDF膜上，封閉液封閉1 h，之后加入一抗于4℃搖床孵育過夜，洗滌后，加入相應的HRP標記的二抗室溫孵育1 h，最后用BeyoECL Plus化學發光試劑盒顯色，X線片顯影，Fluor Chem 8000成像儀（AlphaInnotech）記錄結果，并用Alpha Ease FC軟件（AlphaInnotech）分析結果。

1.2.4 統計學分析 所有免疫印跡實驗均獨立重復3次，數據以±s表示，用GraphPad Prism 4.0軟件進行單因素方差分析，組間比較采用Newman-Keuls檢驗。

2 結果

2.1 CuE對HeLa細胞增殖的影響 如Fig 1所示，CuE對HeLa細胞增殖的抑制效應呈劑量依賴性。藥物處理24 h，半數抑制濃度（IC50）為4.01 μmol·L-1；藥物處理 48 h，IC50為 0.06μmol·L-1。以下實驗藥物處理時間最長為24 h，因此選用24 h的 IC50附近的3個濃度（0.1、1、10μmol·L-1）用于進一步的實驗。

Fig 1 Inhibitory effect of cucurbitacin E（CuE）on proliferation of HeLa cells**P＜0.01 vs control

2.2 CuE劑量依賴性抑制p70S6K的磷酸化作用p70S6K是已知的mTORC1的底物蛋白，是蛋白質翻譯的關鍵調控因子之一，其磷酸化水平顯示mTORC1的活性［10］。如Fig 2A所示，使用不同濃度的藥物處理HeLa細胞2 h后，p70S6K的磷酸化水平受到明顯抑制，且呈劑量依賴性。CuE在1μmol·L-1濃度時，p-p70S6K的水平下調明顯，10μmol·L-1時已檢測不到磷酸化蛋白的表達。同時，1 μmol·L-1濃度的CuE處理另一細胞株MCF7細胞后，p70S6K的磷酸化水平也受到明顯抑制，且呈時間依賴性；在藥物處理2 h后，已檢測不到磷酸化蛋白的表達。

2.3 CuE對mTORC1下游信號蛋白磷酸化的時間依賴性效應 進一步以1μmol·L-1的CuE分析其對mTORC1下游信號蛋白活化的時間依賴性效應。除了p70S6K，4E-BP1是mTORC1的另外一個底物，它通過和真核細胞翻譯啟動因子4E（elF-4E）結合，從而抑制蛋白質翻譯；核糖體 S6蛋白是p70S6K的下游蛋白，經p70SK激酶作用磷酸化，增強 mRNA的翻譯［10］。如 Fig 3所示，CuE（1μmol·L-1）處理細胞后，可明顯下調p-p70S6K和p-S6的水平，且呈時間依賴性；然而，CuE同時上調4E-BP1和p-4E-BP1的表達，也呈時間依賴性。這提示CuE對mTORC1活性的抑制作用具有底物特異性。

Fig 2 Inhibitory effect of CuE on phosphorylation of mTORC1 substrate p70S6KA：CuE inhibited the phosphorylation of p70S6K in a dose-dependent manner in HeLa cells；B：CuE inhibited the phosphorylation of p70S6K in a time-dependent manner in MCF7 cells.The relative densitometry ratios of p-p70S6K against its total p70S6K are shown under each band.

Fig 3 Time-dependent effect of CuE on phosphorylation of downstream signaling proteins of mTORC1 in HeLa cellsThe relative densitometry ratios of the downstream signaling proteins of mTORC1 against their respective total proteins orβ-tubulin（for p-S6）are shown under each band.

2.4 CuE對自噬相關蛋白 LC3和 p62／SQSTM1的影響 LC3（microtubule-associated protein 1 light chain 3）是哺乳動物中的Atg8同源蛋白，細胞自噬過程中，可溶性的LC3-Ⅰ轉化為膜結合型的LC3-Ⅱ，后者較前者具有更高的電泳遷移率；LC3-Ⅱ的相對含量以及兩者的比例能夠反映自噬小體的數量，是常用的自噬小體標志物，用于評價細胞自噬的水平［12］。p62／SQSTM1蛋白起著連接 LC3蛋白和泛素化底物的作用，從而將被降解物納入自噬小體中，并最終被自噬溶酶體降解。CuE處理細胞24 h后能使LC3-Ⅱ的表達明顯上調，并呈劑量依賴性（Fig 4A，4B）。以溶酶體抑制劑 CQ（20μmol·L-1）預處理細胞1 h后，再以CuE處理細胞不同時間后，LC3-Ⅱ的表達比單獨CuE處理更高（Fig 4C，4D），說明CuE確實誘導了細胞自噬，而不是由于阻斷自噬小體與溶酶體的融合和降解。同時，CuE處理后，細胞內 p62／SQSTM1的水平下降（Fig 4E，4F），進一步說明CuE確實誘導了HeLa細胞發生了細胞自噬。

2.5 CuE抑制ULK1的磷酸化 ULK（Unc-51-like kinase）是哺乳動物細胞內存在的Atg1的同源蛋白，mTORC1可通過使ULK1磷酸化而抑制細胞自噬。CuE處理細胞不同時間后，p-ULK1S757的表達量降低（Fig 5），說明CuE可能通過抑制mTORC1下調p-ULK1S757水平，從而解除對自噬啟動步驟的抑制，誘導細胞自噬的發生。

3 討論

細胞自噬是一種自我降解的過程，是調節細胞內穩態的重要途徑，也是細胞面對各種環境應激（包括藥物）時的主要存活機制［4］；細胞自噬的激活能為處于營養缺乏等應激條件下的細胞提供氨基酸、脂類等營養物質，有助于細胞抵抗死亡信號而度過難關；另一方面，自噬的過度活躍則會過度損傷細胞器，促進自噬性細胞死亡或通過激活凋亡／壞死通路誘導細胞死亡［4］。mTORC1在調控細胞自噬過程中發揮重要作用。p70S6K作為mTOR的重要底物，其磷酸化水平反映了mTORC1的活性［10］。我們在本研究中發現，CuE可能通過抑制mTORC1活性（通過測定p-p70S6K的磷酸化水平顯示），進而抑制自噬啟動環節的ULK1的磷酸化水平，上調LC3-Ⅱ的表達（自噬小體的形成），從而誘導細胞自噬的發生。

自噬小體的形成是自噬過程中的核心步驟。PI3K（class Ⅲ phoshatidylinositol 3-kinase）復合體參與早期吞噬泡膜的組裝［13］。PI3K復合體與Atg13、Atg20及Atg24等蛋白結合，進而招募兩類泛素結合系統Atg12-Atg5-Atg16和Atg8-PE到吞噬泡（phagophore）上，最后形成完整的自噬小體。哺乳動物內Atg8的同源物LC3與磷脂酰乙醇胺（PE）結合，形成LC3-Ⅱ（即LC3-PE），定位于自噬小體的內膜和外膜，作為自噬小體形成的標記蛋白［12］。我們發現，CuE使細胞中LC3-Ⅱ表達量增加，使用CQ預處理細胞，LC3-Ⅱ表達量進一步升高，說明CuE確實誘導了細胞自噬。而p62的降解，說明自噬小體與溶酶體融合并被降解，細胞自噬進程是完整的。

我們進一步探討了CuE抑制mTORC1與誘導自噬的相關性。mTORC1可磷酸化ULK1的S757位點而抑制細胞自噬，抑制 mTORC1活性則使S757位點磷酸化水平下降，ULK1的多個其它位點被磷酸化，從而激活ULK1，進而磷酸化Atg13和FIP200，最終誘導自噬的發生［14］。本研究顯示，CuE能抑制mTORC1的活性，進而下調p-ULK1S757的表達，CuE引起的ULK1S757磷酸化水平下調可能是其誘導自噬的重要機制。然而，CuE是否影響到ULK1其它位點的磷酸化，則需要進一步的研究闡明。

Fig 4 Effect of CuE on levels of autophagy-associated proteins in HeLa cellsA：CuE elevated the expression of LC3-Ⅱ in a dose-dependent manner；B：Histograms of the relative densitometry ratios of LC3-Ⅱ againstβ-tubulin；C：CuE further increased the expression of LC3-Ⅱ in the presence of CQ；D：Histograms of the relative densitometry ratios of LC3-Ⅱ againstβ-tubulin；E：CuE decreased the levels of p62／SQSTM1；F：Histograms of the relative densitometry ratios of p62／SQSTM1 againstβ-tubulin.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control.

Fig 5 CuE decreased the phosphorylation levels of ULK1 in HeLa cellsThe relative densitometry ratios of p-ULK1 against the total ULK1 are shown under each band.

據我們所知，CuE抑制mTORC1的現象尚未見報道，但以往的研究已報告了葫蘆素 B能抑制mTOR的活性［8］，這與我們的研究結果相一致。Zhang等［6］報道葫蘆素B和I通過促進線粒體來源的ROS產生，激活MAPK信號通路而誘導自噬，這與我們的研究結果不一致，其原因尚不清楚。然而，以往的研究在人A357和小鼠B16F10黑素瘤細胞中證明葫蘆素B并不能提升ROS水平［7］，這提示在不同的細胞中，葫蘆素B誘導自噬的機制可能不同。我們還在另一細胞株MCF7細胞上發現CuE能抑制mTORC1的活性，提示CuE對mTORC1的抑制作用可能是一種普遍現象。

雷帕霉素作為mTORC1的特異性抑制劑，能夠明顯下調p-p70S6K的水平，但卻可上調p-4E-BP1的表達水平［15］。這與我們在CuE上的研究結果相似，說明CuE抑制mTORC1的作用具有底物特異性。需要指出，本研究觀察到CuE抑制mTORC1活性，但這種抑制作用的分子機制尚不清楚。以往的研究表明，CuE影響肌動蛋白聚集，破壞肌動蛋白細胞骨架結構［2］，而肌動蛋白聚集與mTORC1是否存在相互作用，還需進一步研究闡明。

綜上所述，CuE通過抑制mTORC1活性，調控mTORC1信號通路，在HeLa細胞中誘導細胞自噬。這一研究結果為進一步探索CuE的作用機制及其在抗腫瘤、抗病毒、抗炎中的作用提供實驗依據。

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