黃芩苷對皮膚鱗癌細胞生長和遷移能力的影響

楊子良，駱 丹，林秉獎，錢齊宏，余秀琴，王淼淼，閔 瑋

（1.蘇州大學第一附屬醫(yī)院皮膚科，江蘇蘇州 215006 2.南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院皮膚性病科，江蘇南京 210029）

皮膚鱗狀細胞癌（squamous cell carcinoma，SCC）是源于表皮角質(zhì)形成細胞的一種惡性腫瘤，其發(fā)病率近年來呈逐年上升的趨勢，其病情發(fā)展較快并可發(fā)生轉移，已日益成為威脅人類健康的主要皮膚腫瘤［1］。日光中的紫外線（ultraviolet radiation，UV），尤其是中波紫外線（UVB，波長290～320 nm）是導致皮膚SCC發(fā)生的主要環(huán)境因素［2-3］。黃芩苷（baicalin）是唇形科植物黃芩的主要有效成分之一，已證實黃芩苷具有抗腫瘤的作用，但其具體作用機制目前尚未完全明了［4］。絲切蛋白-1（cofilin-1）是一種重要的癌細胞轉移和入侵的調(diào)節(jié)因子［5］，我們前期實驗中發(fā)現(xiàn)，黃芩苷和UVB可明顯影響人表皮細胞中cofilin-1的表達［6］。本文將觀察黃芩苷和cofilin-1對人皮膚鱗癌細胞的影響，并對相關機制進行探討。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑 人皮膚鱗狀細胞癌細胞株A431購自中國科學院上海細胞生物研究所，黃芩苷購自中國藥品生物制品檢定所，BCA蛋白定量試劑盒Pierce公司，cofilin-1和 β-actin抗體購自 Santa Cruz公司，siRNA由百奧邁科生物技術有限公司合成，脂質(zhì)體Lipofectamin 2000和TRIzol購自Invitrogen公司，PCR引物由上海生工合成，逆轉錄試劑盒和實時定量PCR試劑盒購自大連TaKaRa公司，CCK-8試劑盒購自中國Beyotime生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) A431細胞在培養(yǎng)于37℃、5%CO2條件下的細胞培養(yǎng)箱中。當細胞生長至80%融合時，以0.25%胰酶消化，用含10% 小牛血清的DMEM培養(yǎng)基調(diào)整其濃度為1×109·L-1，定量接種于培養(yǎng)板和培養(yǎng)皿中，繼續(xù)培養(yǎng)。黃芩苷組在檢測前24 h加入終濃度為50 mg·L-1黃芩苷的培養(yǎng)基進行孵育。

1.2.2 Western blot檢測cofilin-1表達 50 mg·

L-1黃芩苷孵育24 h后收集細胞，加入細胞裂解液，用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。12%SDSPAGE分離蛋白后轉移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉 1 h，加入抗 cofilin-1（1∶1 000）和 β-actin（1∶200）抗體，4℃孵育過夜，加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗室溫孵育1 h，ECL化學發(fā)光檢測顯影，Quantity One圖像分析軟件對所得條帶進行定量分析。

1.2.3 Cofilin-1-siRNA設計合成及轉染 根據(jù)GenBank報道的cofilin-1基因序列，在siRNA設計網(wǎng)站（http：／／jTra.wi.mit.edT／bioc／siRNAext／siRNA_search.cgi？tasto＝2053962827）設計特異性針對cofilin-1基因shRNA片段CFL1-497-siRNA，其序列為：正向 5′-CCUAUGAGACCAAGGAGAGdTdT-3′，反向 5′-CUCUCCUUGGUCUCAUAGGdTdT-3′，同時 設計了1個與人類基因同源性差的無關序列作為負對照。選擇處于對數(shù)生長期的A431細胞，調(diào)整細胞密度為1.2×108cells·L-1，接種于培養(yǎng)板，保證轉染前匯合度50%左右；轉染步驟按照Lipofectamin 2000說明書推薦進行：使用前輕輕混合 Lipofectamine 2000并在室溫下孵育5 min，然后混合稀釋的siRNA和稀釋的Lipofectamine 2000，在室溫下孵育20 min，以便允許復合物的形成。將siRNA-LipofectamineTM2000復合物加入到每一個包含細胞和培養(yǎng)基的孔中。通過輕輕地前后搖動培養(yǎng)板混合。

1.2.4 實時定量PCR檢測沉默效果 轉染后，24、48和72 h收集細胞，用 TRIzol試劑提取細胞總RNA并逆轉錄合成cDNA，凍存置于-80℃冰箱中備用。根據(jù)cofilin-1基因序列和內(nèi)參GAPDH序列，用Beacon Designer 7.5軟件設計相應的引物和熒光探針，cofilin-1上游引物序列5′-ACAAGAAGAACATCATCCTG-3′，下 游 引 物 序 列 5′-ATAGCGGCAGTCCTTATC-3′；GAPDH 上 游 引 物 序 列 5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′，下游引物序列 5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′；取上述 cDNA產(chǎn)物各5μl作為模板進行PCR擴增，PCR反應體系為25μl：逆轉錄產(chǎn)物5μl，2×QuantiTect SYBR Green I RT-PCR Master Mix 12.5μl；上游引物、下游引物（10 mol·L-1）各 0.5μl；Taqman Probe 0.5μl；無 DNAase水6μl。反應條件為：95℃5 min，95℃20 s→60℃1 min→72℃30 s（×45 Cycle）測定吸光值。

1.2.5 CCK-8法檢測細胞增殖情況 于黃芩苷孵育后24、48、72 h分別收集cofilin-1 siRNA處理后各組細胞，每孔加入10μl CCK-8溶液（加入的體積一般為原來培養(yǎng)液體積的10%）；細胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育2 h，于酶標儀上測定450 nm處吸光度（A值）。

1.2.6 劃痕試驗檢測A431細胞的遷移情況 將細胞分為對照組、脂質(zhì)體組、黃芩苷組、cofilin-1-siRNA組和黃芩苷+cofilin-1-siRNA組，把各組細胞接種于6孔板中，待細胞生長至融合時，用無菌20μl槍尖垂直線性劃痕，PBS漂洗去除脫落細胞后無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，劃痕后0、24 h隨機選擇劃痕區(qū)中的3個視野拍照，比較各組間劃痕愈合的差異，用愈合率代表細胞遷移愈合能力。愈合率／%＝［（愈合前細胞間空白區(qū)域面積-愈合后細胞間空白區(qū)域面積）／愈合前細胞間空白區(qū)域面積］×100%。

1.2.7 統(tǒng)計學分析 以SPSS 11.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析，結果用ˉx±s表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。

2 結果

2.1 黃芩苷對 cofilin-1蛋白表達水平的影響 50 mg·L-1黃芩苷孵育A431細胞24 h后，Western blot分析顯示細胞中cofilin-1蛋白的表達水平明顯下降，與對照組相比，黃芩苷組cofilin-1蛋白表達下降了49.3%，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見Fig 1。

Fig 1 Effect of baicalin treatment on cofilin-1 protein expressionThe expression level of cofilin-1 was detected by Western blot relative toβ-actin in A431 cells.Protein extracts were separated in PAGE gels and transfered to membrane filters.The protein bands were visualized using the ECL method.Data are expressed asˉx±s of three individual experiments.**P＜0.01 vs control group.

2.2 定量PCR檢測cofilin-1 mRNA表達 Cofilin-1-siRNA轉染入A431細胞后，分別于轉染后24、48、72 h收集各組細胞，提取總RNA，實時定量PCR檢測結果顯示，各時間段的細胞cofilin-1 mRNA表達水平均明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），表明cofilin-1基因的表達受到明顯抑制，見Fig 2。

2.3 Cofilin-1 siRNA對A431細胞增殖活性的影響 將細胞分為對照組、脂質(zhì)體組、黃芩苷組、cofilin-1-siRNA組和黃芩苷+cofilin-1-siRNA組，在黃芩苷孵育和轉染后繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h，以CCK-8法檢測細胞增殖活性。結果顯示，與對照組相比，黃芩苷組和cofilin-1-siRNA組的細胞的增殖活性明顯降低（P＜0.05）；而黃芩苷 +cofilin-1-siRNA組的細胞活性下降最明顯，且隨著時間延長無恢復趨勢，見Fig 3。

Fig 2 Effect of cofilin-1 RNA interference on cofilin-1 mRNA level in A431 cellsˉx±s，n＝3）The siRNA transfections were performed using the Lipofectamin2000 kit.Quantitative real-time PCR analysis of cofilin-1 expression in A431 cells was performed.*P＜0.05 vs control group and siRNA-NC group.

Fig 3 Effects of cofilin-1 silencing and baicalin on proliferation activity in A431 cells（ˉx±s，n＝3）Cells were plated at a density of 1×107 cells·L-1 cultured at various times（24，48，and 72 h）in medium containing baicalin at 50 mg·L-1 concentration.Cell viability was assayed using the CCK8 method.The untreated cells served as controls.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs CFL-siRNA group and baicalin group.

Fig 4 Effects of cofilin-1 silencing and baicalin on cell migration in A431 cellsCells were incubated with baicalin for 24 h after cofilin-1 silencing.The cell migration was analyzed using wound healing assay.Data are presented as±s of three individual experiments.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs CFL-siRNA group and baicalin group.

2.4 黃芩苷和cofilin-1 siRNA對A431細胞遷移能力的影響 細胞劃痕實驗結果顯示，劃痕后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，各組間細胞間隙均有一定程度愈合，其中黃芩苷組及CFL1-siRNA組與對照組相比，劃痕愈合程度明顯下降，分別為54%和40%；而黃芩苷合并cofilin-1-siRNA干預時，細胞的遷移愈合能力則進一步下降為21%，各組間的差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見 Fig 4。

3 討論

皮膚鱗癌的發(fā)生與紫外線輻射密切相關，隨著環(huán)境及臭氧層破壞加重，其發(fā)病率一直呈持續(xù)上升趨勢。與另一種常見的皮膚基底細胞癌（basal cell carcinoma，BCC）相比，皮膚鱗癌的病情發(fā)展快，破壞性大，可發(fā)生淋巴結轉移，晚期可發(fā)生內(nèi)臟轉移，因此其防治越來越受人們關注。近年已有大量研究表明，許多傳統(tǒng)中藥具有較強的抗癌療效，并在誘導腫瘤細胞凋亡、促進分化以及提高免疫功能方面有其獨有的優(yōu)勢［7］?，F(xiàn)代藥理研究表明，傳統(tǒng)中藥黃芩具有抗菌、抗病毒、抗炎、抗氧化及抗腫瘤等多種藥理作用，其主要有效成分黃芩苷報道可抑制肝癌、肺癌、卵巢癌和乳腺癌等惡性腫瘤細胞的生長［8-9］。我們在前期研究中發(fā)現(xiàn)，黃芩苷可有效抵抗紫外線輻射，保護皮膚細胞免受損傷，同時黃芩苷還可一定程度上抑制皮膚鱗癌細胞的生長活性［10-11］，但其效果和作用機制還未完全明了。

cofilin-1是存在于真核生物中的一種低分子量肌動蛋白結合蛋白，廣泛參與細胞凋亡、胞質(zhì)分裂等，其基本功能是在細胞內(nèi)結合，并解聚F肌動蛋白（F-actin），從而調(diào)節(jié)肌動蛋白骨架的重組，對細胞遷移起到重要作用，是重要的癌細胞轉移和入侵的調(diào)節(jié)因子［12］。我們之前在蛋白組學實驗中發(fā)現(xiàn)，UVB可引起表皮細胞中cofilin-1的高表達，而加入黃芩苷可明顯抑制這種表達。為了進一步明確黃芩苷對皮膚腫瘤的抗癌作用與機制，本研究首先采用50 mg·L-1黃芩苷干預人皮膚鱗癌A431細胞，結果顯示，A431細胞中的cofilin-1蛋白水平明顯下降，表明黃芩苷可在一定程度上抑制cofilin-1的表達。接著我們構建cofilin-1特異性siRNA并轉染A431細胞，定量PCR檢測證實成功沉默細胞中的cofilin-1基因表達。我們進一步觀察了cofilin-1沉默表達和黃芩苷對A431細胞活性的影響，CCK-8實驗結果顯示，分別使用黃芩苷孵育和cofilin-1-siRNA干預均可使細胞增殖活性明顯降低，而黃芩苷合并cofilin-1-siRNA干預時細胞活性進一步下降，且這種抑制作用沒有隨著培養(yǎng)時間的延長而減弱。cofilin-1與腫瘤細胞的遷移和侵襲作用密切相關，我們利用細胞劃痕實驗觀察了cofilin-1沉默和黃芩苷對細胞遷移能力的影響，結果表明黃芩苷和cofilin-1-siRNA處理均可降低細胞的遷移能力，而黃芩苷合并cofilin-1-siRNA干預時細胞的遷移愈合能力下降最為明顯，僅為對照組細胞的21%。上述結果表明，黃芩苷對人皮膚鱗癌細胞的生長與遷移能力均有一定抑制作用，調(diào)控cofilin-1基因表達可能是上述效應的作用機制之一，而沉默cofilin-1表達則能明顯增強黃芩苷對皮膚腫瘤的抗癌作用，但具體機制及相關調(diào)控環(huán)節(jié)尚待進一步研究闡明。

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