白藜蘆醇對K562白血病細胞抑制增殖和誘導分化的作用

趙燕娜，高瑞蘭，汪麗佩，余瀟苓，尹利明

（1.浙江中醫藥大學附屬第一醫院血液病研究所，浙江杭州 310006；2.浙江中醫藥大學基礎醫學院病理學教研室，浙江杭州 310053）

白血病是嚴重危害人類生命健康的造血系統惡性腫瘤，其發病率和死亡率在兒童和青年的惡性腫瘤中位居首位，其生物學特征是造血細胞增殖失控、分化成熟受阻、正常凋亡過程發生障礙、異常分化的細胞大量增殖。目前臨床上常用的白血病細胞分化誘導劑有維甲酸及其衍生物、砷劑等，但其治療范圍僅限于急性早幼粒細胞白血病，應用范圍局限，且有一定的毒副作用，長期應用仍有爭議。由于天然化合物的毒性小，逐漸成為研究白血病分化的熱點。白黎蘆醇（resveratrol，Res），化學名 3，4’，5-三羥基-反 -均二苯代乙烯（3，4’，5-trihydroxystilbene），分子式C14H12O3，分子質量：228.2，屬于非黃酮類多酚化合物［1］。對人體具有調節脂質代謝、抑制血小板聚集、保護心血管、抗炎、抗腫瘤［2-3］等多種生物學活性和藥理作用。有研究發現Res能夠誘導白血病細胞凋亡和促進分化［4］，但是其機制尚不明確。

GATA-1是造血細胞紅系分化和成熟過程中的核心轉錄因子，主要調節紅系和巨核系分化。PU.1是另一個早期髓細胞發育的關鍵調節蛋白，主要在髓系和B淋巴細胞中表達。二者相互作用構成一個造血調控網絡，其活性下降容易誘發骨髓的惡性轉化［5］。基于以上理論，本研究以具有多向分化潛能的K562白血病細胞株作為研究對象，觀察特異性轉錄因子GATA-1和PU.1，以及白血病細胞的分化相關抗原陽性細胞表達率，探討Res抑制K562細胞增殖、誘導分化的作用機制，為篩選抗白血病藥物提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料 K562細胞由本實驗室保存，Res購自美國Sigma公司，IMDM培養基購自美國 Gibco公司，小牛血清購自杭州四季青公司，PE標記的小鼠抗人CD11b、CD14、CD42b抗體、購自美國BD公司，GATA-1、PU.1抗體購自美國Cell Signaling Technology公司，β-actin內參抗體購自聯科生物技術有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 將K562細胞常規培養于含10%小牛血清的IMDM完全培養基中，置于37℃，5%CO2飽和濕度培養箱中培養，2 d換液傳代1次，取對數生長期細胞用于后續實驗。

1.2.2 半固體集落生成實驗 計數并調整細胞濃度為5×106·L-1，進行K562白血病細胞集落培養，分別加入白藜蘆醇使其終濃度為0、6.25、12.5、25、50、100μmol·L-1。培養體系為：IMDM培養液、30%小牛血清、1%L-谷氨酰胺、100U青／鏈霉素、0.3%瓊脂，接種于24孔板，每孔接種0.5 ml，重復3孔。置于37℃、5%CO2的飽和濕度培養箱中培養6 d。以大于40個細胞的聚合為一個K562白血病細胞集落，記錄白血病細胞集落數，并計算抑制率／%＝（對照組集落數-實驗組集落數）／對照組集落數×100%，每組實驗重復3次。

1.2.3 流式細胞術檢測分化相關抗原陽性細胞的表達率 收集各組細胞，PBS洗滌并調整細胞濃度為1×1011·L-1，取50μl細胞懸液分別加入分化相關抗原CD11b、CD14、CD42b單克隆抗體，4℃孵育30 min，PBS洗去未結合的抗體，上機檢測，每一個檢測標本記錄10 000個細胞。DIVA軟件進行陽性率的分析，每組實驗重復3次。

1.2.4 細胞免疫化學 收集細胞，調整細胞濃度為1×109·L-1取 100μl，800 r·min-1離心 5 min甩片。4%多聚甲醛固定，0.5%Triton X-100破膜。分別加一抗GATA-1、PU.1于4℃孵育（濕盒）過夜，二抗工作液（濕盒）37℃ 孵育30 min。DAB顯色10 min。蘇木素復染，中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察陽性細胞染色程度。

1.2.5 Western blot法檢測K562細胞內GATA-1、PU.1蛋白表達量 收集細胞，提取蛋白。將40μg的總蛋白混合上樣緩沖液，100℃加熱5 min使蛋白變性，10%SDS-PAGE膠分離，蛋白條帶轉到PVDF膜上，1%BSA封閉后，一抗4℃孵育過夜，辣根過氧化物酶標記的二抗孵育，ECL顯影，β-actin為內參蛋白。用計算機熒光掃描系統掃描并記錄結果，以目的蛋白條帶×灰度值／（內參蛋白×灰度值）的比值代表目的蛋白的表達水平，每組實驗重復3次。

Fig 1 Res inhibited the colon number of K562 cell in semi-solid culture assay（n＝3）*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group

Fig 2 Expression of CD14，CD42b and CD11b in K562 cells by flow cytometryA：CD14；B：CD42b；C：CD11b

1.2.6 統計學處理 采用SPSS17.0軟件進行數據分析，計量資料以±s表示，加藥組與對照組比較采用方差分析。

2 結果

2.1 白藜蘆醇對K562細胞半固體集落生成的影響 不同劑量的白藜蘆醇處理K562細胞6d后，隨著劑量的增加，K562白血病細胞集落數明顯低于實驗對照組，呈一定的劑量依賴關系（Fig 1）P＜0.01。白藜蘆醇 6.25、12.5、25、50和 100μmol·L-1組抑制率分別為13%±1.2%、28%±4%、53%±10%、63%±7%和90%±3%，均明顯高于陰性對照組，P＜0.05或P＜0.01。

2.2 白藜蘆醇提高K562細胞分化相關抗原陽性細胞的表達率 白藜蘆醇處理K562細胞6 d后，流式細胞術檢測K562細胞分化程度，結果顯示白藜蘆醇可誘導K562細胞分化相關抗原CD42b、CD11b和CD14的表達陽性率均明顯高于對照組，且呈一定的劑量依賴關系（Fig 2）。

2.3 白藜蘆醇對K562細胞中 GATA-1和PU.1蛋白表達水平的影響 不同濃度白藜蘆醇處理K562細胞6d后，細胞免疫化學結果顯示隨著劑量的增加GATA-1和PU.1蛋白表達明顯高于對照組（Fig 3，4）。Western blot法的結果與細胞免疫化學的結果基本一致，白藜蘆醇處理后的K562細胞蛋白條帶的灰度值明顯高于對照組，P＜0.05或P＜0.01（Fig 5）。

Fig 3 Expressions of GATA-1 in K562 cells was detected with cell immunochemistry（400×）A：Control；B：Res 25μmol·L-1；C：Res 50μmol·L-1；D：Res 100μmol·L-1

3 討論

Fig 4 Expressions of PU.1 in K562 cells was detected with cell immunochemistry（400×）A：Control；B：Res 25μmol·L-1；C：Res 50μmol·L-1；D：Res 100μmol·L-1

Fig 5 Expression of GATA-1 and PU.1 in K562 cells was anayzed with Western blot（A）K562 cells were treated with Res for 6 days，and the cell lysates were subjected to Western blot analysis for GATA-1 and PU.1.Beta-actin served as an equal loading control.Histograms（B）showed the relative expression of GATA-1 and PU.1（normalized to actin）as compared to the vehicle-treated cell.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group.

目前臨床上常用的白血病細胞分化誘導劑有維甲酸及其衍生物、砷劑等，但因其應用范圍局限，毒副作用大，長期應用仍有爭議。人髓系白血病K562細胞株在一定條件下可向紅系、粒-單系和巨核系細胞分化，是研究白血病細胞增殖與分化的理想細胞模型。白黎蘆醇作為新興綠色保健藥和抗癌藥，已有報道發現［6-8］，白藜蘆醇能夠誘導白血病細胞凋亡和自噬。Yan等［9］采用白藜蘆醇作用于K562白血病細胞株后，檢測 GPA、HBA1、HBB和 γ-珠蛋白的表達，觀察白藜蘆醇誘導K562細胞向紅系分化。本實驗以白血病細胞分化相關轉錄因子GATA-1和PU.1蛋白及分化相關抗原為觀察指標，觀察白藜蘆醇誘導K562細胞向紅系、粒系和巨核系分化的作用。利用其多向分化的能力，主要觀察Res抑制增殖，誘導白血病分化作用。結果顯示白藜蘆醇明顯提高K562細胞分化相關抗原CD11b、粒-單系細胞分化抗原CD14、巨核系細胞分化抗原CD42b及紅系特異性核轉錄因子GATA-1蛋白和轉錄因子PU.1蛋白的表達。提示白藜蘆醇可能具有誘導白血病細胞株K562細胞向紅系、粒系和巨核系分化的作用，其中誘導紅系分化作用尤為明顯。白藜蘆醇誘導分化的作用機制仍需深入研究，為白藜蘆醇今后的臨床應用提供理論基礎。

參考文獻：

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