β1-AR對心衰心室肌細胞快激活延遲整流鉀電流的調控機制

汪和貴，王 森，陳艷紅，鄒建剛，柯永勝

（1.皖南醫學院弋磯山醫院心內科，安徽 蕪湖 241001；2.南京醫科大學第一臨床醫學院心臟科，江蘇南京 210029）

慢性心衰患者易在運動和情緒激動等交感神經興奮的情況下，誘發惡性室性心律失常甚至猝死。快激活延遲整流鉀電流（IKr）是心肌細胞復極3期的主要鉀電流，在心肌細胞動作電位復極過程中起關鍵作用［1］。最近的實驗研究證明一些G蛋白偶聯受體，如α-AR和 β-AR通過細胞內 cAMP、PKA和PKC調節hERG通道的功能［2-6］。這些研究表明腎上腺素的刺激影響hERG通道的活性。但是，目前β-AR對心衰心室肌細胞IKr／hERG通道的調控及其細胞內信號機制知之甚少，有待深入研究。因此，本研究分離豚鼠心室肌細胞，采用全細胞膜片鉗技術，觀察β1-AR瞬時激活對心衰心室肌細胞IKr的調控，并初步探討其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 實驗動物：♂豚鼠，體質量200～250 g，由南京青龍山動物中心提供。所有實驗動物的管理均遵循中華人民共和國衛生部動物實驗管理條例。

1.2 主要試劑、溶液及儀器 扎莫特羅（Xamoterol，選擇性 β1-AR激動劑）、CGP20712A（選擇性β1-AR阻滯劑）、KN93（特異性CaMKⅡ抑制劑）購自美國Sigma公司；KT5720（特異性PKA抑制劑）購自Merck公司。

臺氏液 （mmol· L-1）：NaCl 137，KCl 5.4，NaH2PO40.33，HEPES 10，Glucose 10，CaCl21.8，pH 7.4 with NaOH；無鈣液（mmol·L-1）：NaCl 137，KCl 5.4，NaH2PO40.33，HEPES 10，Glucose 10，pH 7.4 with NaOH；KB液（mmol·L-1）：KOH 85，L-Glu 70，Tuarine 20，KCl 20，KH2PO430，HEPES 10，Glucose 10，EGTA 0.5，pH 7.4 with KOH；電極內液（mmol·L-1）：Potassium aspartate 120，KCl 20，MgCl22.0，HEPES10，EGTA 10，Na2ATP 10；pH 7.2 with KOH。細胞外液（mmol·L-1）：Choline Chloride 137，KCl 5.4，MgCl21，CaCL21.8，PES 10，Glucose 10，CoCl22，pH 7.4 with KOH。記錄IKr尾電流時細胞外液中加入 nifedipine（1μmol·L-1）及 chromanol293B（10 μmol·L-1）。

RM6240多道生理信號采集處理系統，中國成都儀器廠；心臟超聲心動圖，Sonos 5500，Hewlett Packard，美國；膜片鉗放大器，EPC-9，HEKA，德國。

1.3 心衰模型制備與分組 豚鼠皮下注射阿托品（0.10 mg·kg-1），腹腔內注射戊巴比妥鈉（30 mg·kg-1）麻醉，1%利多卡因局麻、消毒、氣管插管、正壓通氣。在胸部左側第3、4肋間隙縱行剪開皮膚，打開胸腔，分離出降主動脈，縮窄降主動脈，抽吸胸腔，荷包縫合，拔除氣管插管，恢復自主呼吸。術后豚鼠側臥，肌肉注射青霉素（4×105U·kg-1）預防感染，保暖，補充水、飼料和蔬菜。術后模型組及假手術對照組同室喂養12周，每天觀察豚鼠呼吸、毛發色澤及活動情況。

心臟超聲心動圖檢查由同一資深超聲技術人員進行操作。應用Sonos 5500型超聲心動圖檢查儀，心臟探頭11-3L，頻率為10MHz。用二維切面超聲，選取豚鼠左室長軸、短軸和心尖四腔切面結合M型和多普勒超聲進行檢查，主要觀察左室內徑大小，測量左室舒張末內徑（LVEDd）、左室收縮末內徑（LVESd）、短軸縮短率（FS）；心臟左室射血分數（EF值）由超聲儀軟件自動計算所得。所有數值均測量3個連續心動周期，然后取其平均值，以排除測量時的人為誤差。

將分離出的對照組與心衰組豚鼠心室肌細胞，分為：空白對照組、PKA抑制劑組（細胞用2.5μmol·L-1特異性 PKA抑制劑 KT5720孵育1 h）及CaMKⅡ抑制劑組（細胞用10μmol·L-1特異性CaMKⅡ抑制劑KN93孵育30 min）。心肌細胞與玻璃微電極封接、破膜后，記錄給藥前的IKr尾電流，再給予10μmol·L-1扎莫特羅灌流，記錄IKr尾電流。

1.4 IKr電流及動作電位記錄方法 在電壓鉗模式下，從-40mV開始以階躍電壓20mV的方式逐步去極化至40mV，脈寬200 ms，刺激從相應電壓降至-40mV，脈寬600 ms，誘發IKr外向尾電流。

在電流鉗模式下，采用膜片鉗技術記錄豚鼠心室肌細胞膜動作電位（APD）；給予脈寬5 ms，以1Hz頻率電流刺激誘發動作電位。記錄扎莫特羅對心衰心室肌細胞APD的作用時，在細胞外液中加入nifedipine（1μmol·L-1）及 chromanol（10μmol·L-1）。

1.5 統計學分析 膜片鉗數據采用IGOR軟件（IGOR Pro4.0+，HEKA，Germany）進行分析，實驗結果均采用±s表示，用SPSS 16.0軟件進行統計分析，配對資料采用配對t檢驗，多組比較采用方差分析。

2 結果

2.1 豚鼠慢性心衰模型的有效性 縮窄豚鼠降主動脈12周后，采用心臟超聲心動圖檢測豚鼠左心室內徑及心功能的變化（Tab 1，Fig 1），結果顯示：心衰組豚鼠左室射血分數（EF）及左室短軸縮短率（FS）與對照組比較明顯降低（P＜0.01）；心衰組豚鼠左室舒張末期內徑（LVEDd）及左室收縮末期內徑（LVSDd）與對照組比較明顯增大（P＜0.05，和 P＜0.01）。采用心電圖檢測心衰豚鼠QTc的變化，結果顯示：心衰組豚鼠QTc與對照組比較明顯延長（Tab 1，P＜0.01）。同時觀察到心衰組豚鼠有不同程度的胸水與腹水。

Tab 1 Changes of echocardiography and electrocardiogram in guinea pigs with CHF（n＝10）

Fig 1 Changes of echocardiography in guinea pigs with CHF

2.2 β1-AR激動劑扎莫特羅對心衰心室肌細胞IKr的影響 IKr特異性阻斷劑 dofetilide（1μmol·L-1）完全阻斷IKr外向尾電流（Fig 2），證明該電流為IKr尾電流，不含有其它電流。

在灌流液中加入扎莫特羅（10μmol·L-1）2～3 min后，IKr外向尾電流開始減少，10 min左右IKr尾電流的抑制作用達到穩態。在預刺激電壓為+40mV時，扎莫特羅作用10 min后，對照組心室肌細胞 IKr尾電流減少了（53±4）%（Fig 3A，n＝6，P＜0.01），心衰心室肌細胞IKr尾電流減少了（52±8）%（Fig 3B，n＝6，P＜0.01）。扎莫特羅對兩組心肌細胞抑制程度差異無顯著性。Fig 3C為扎莫特羅對兩組心肌細胞IKr尾電流影響的時程關系。以上結果表明，β1-AR激活抑制心衰豚鼠心室肌細胞IKr尾電流。

2.3 扎莫特羅通過β1-AR抑制心衰心室肌細胞IKr為了進一步證實扎莫特羅是否通過β1-AR抑制心室肌細胞IKr，我們在正常豚鼠及心衰豚鼠心室肌細胞上，應用選擇性β1-AR阻滯劑CGP20712A（10μmol·L-1）預處理后，扎莫特羅作用10 min后，IKr尾電流分別降低了（10±2）%和（8±1）%（P＜0.01與扎莫特羅單獨作用比較，Fig 4）。結果顯示，CGP20712A完全抑制扎莫特羅對心室肌細胞IKr的減弱作用。

2.4 扎莫特羅通過PKA通路抑制IKr在細胞外液中加入特異性PKA抑制劑KT5720（2.5μmol·L-1）預處理1 h后，扎莫特羅（10μmol·L-1）作用10 min后僅使對照組與心衰心室肌細胞IKr尾電流分別減少了（30±2）%與（28±3）%（Fig 5A、B、C）；扎莫特羅（10μmol·L-1）單獨作用使對照組與心衰心室肌細胞IKr尾電流分別減少了（53±4）%、（52±8）%（n＝5或6，P＜0.05與扎莫特羅作用比較，Fig 5C）。結果提示，PKA通路部分介導了扎莫特羅對IKr的抑制作用。

2.5 扎莫特羅不通過鈣調蛋白激酶Ⅱ途徑調節IKr在細胞外液中加入特異性CaMKⅡ抑制劑KN93預處理30 min后，扎莫特羅仍對心室肌細胞IKr產生明顯的抑制作用（Fig 6A、B），與扎莫特羅組比較差異無顯著性（Fig 6C），結果提示，CaMKⅡ通路不參與扎莫特羅對IKr的抑制作用。

Fig 2 Effects of dofetilide on I Kr tail current in CHF ventricular myocytes

Fig 3 Effects of xamoterol on I Kr in CHF ventricular myocytesA and B：Effects of xamoterol on I Kr tail currents in control and CHF ventricular myocytes.C：Time-dependence of current reduction by xamoterol in control and CHF myocytes（n＝6 cells，**P＜0.01，Xamo+CTL vs CTL；##P＜0.01，Xamo+CHF vs CHF）.

Fig 4 Effects of CGP20712A（CGP）on the inhibition of I Kr by xamoterol in CHF ventricular myocytesA and B：Effects of xamoterol in the presence of CGP on the inhibition of I Kr in control and CHF ventricular myocytes.C：A summary of the data expressed as a percentage of decrease of I Kr by xamoterol in the presence of CGP.**P＜0.01，Xamo+CGP vs Xamo.

Fig 5 Effects of KT5720 on the inhibition of I Kr by xamoterol in CHF ventricular myocytesA and B：Effects of xamoterol in the presence of KT5720 on the inhibition of I Kr in control and CHF ventricular myocytes.C：A summary of the data expressed as a percentage of decrease of I Kr by xamoterol in the presence of KT5720.*P＜0.05，Xamo+KT5720 vs Xamo.

Fig 6 Effects of KN93 on the inhibition of I Kr by xamoterol in CHF ventricular myocytesA and B：Effects of xamoterol in the presence of KN93 on the inhibition of I Kr in control and CHF ventricular myocytes.C：A summary of the data expressed as a percentage of decrease of I Kr by xamoterol in the presence of KN93.

2.6 扎莫特羅對心衰心肌細胞動作電位時程的影響 為了記錄扎莫特羅對心衰心室肌細胞ADP的影響，我們在細胞外液中加入nifedipine（1μmol·L-1）及 chromanol（10μmol·L-1），排除扎莫特羅對L型Ca2+通道及IKs通道的作用。結果顯示，扎莫特羅（10μmol·L-1）明顯延長心衰心室肌細胞ADP90［（16.9±1.06）%，n＝4，P＜0.05與心衰組比較，Fig 7］。

Fig 7 Effects of xamoterol（Xamo）on action potential duration in CHF ventricular myoctyes

3 討論

本研究的主要發現：（1）β1-AR激活抑制心衰心室肌細胞IKr；（2）心衰時β1-AR激活通過PKA途徑抑制心室肌細胞的IKr；（3）心衰時β1-AR激活不通過CaMKⅡ途徑抑制心室肌細胞的IKr。

3.1 β1-AR激活抑制心衰心室肌細胞IKr交感神經興奮，兒茶酚胺分泌增加，與細胞膜上G蛋白偶聯的相應受體作用，產生廣泛的生物學效應。最近的研究表明G-蛋白偶聯受體如α-和β-AR通過細胞內cAMP，PKA和PKC調節 hERG鉀通道的功能［2-5］，提示自主神經刺激與心臟復極之間有一定的聯系。

本實驗結果表明，選擇性β1-AR激動劑扎莫特羅（10μmol·L-1）［6］抑制心衰豚鼠心室肌細胞的IKr，延長APD；特異性β1-AR阻斷劑 CGP20712A能夠完全抑制扎莫特羅對IKr的減弱作用，表明扎莫特羅通過β1-AR抑制心衰心室肌細胞的IKr。既往研究［6］報道異丙腎上腺素（10μmol·L-1）抑制正常豚鼠心室肌細胞IKr，主要通過β1-AR起作用。在犬心室肌細胞，Harmati等［3］發現異丙腎上腺素（100 nmol·L-1）增加IKr，由 PKA通路介導。產生結果不一致的原因可能有：（1）實驗技術、方法以及物種不同。Karle等［6］與我們的實驗均采用全細胞膜片鉗技術及相同的動物，實驗結果是一致的。（2）藥物濃度的差異，我們實驗中使用的藥物濃度是Harmati等使用的100倍。（3）β1-AR激活通過與Gs蛋白偶聯，刺激腺苷酸環化酶（AC），導致細胞內cAMP水平增加，cAMP可通過直接與hERG通道中的cBND位點結合增加IKr；另一方面cAMP還能激活 PKA，抑制 IKr，產生雙向調控 IKr的作用［7］。

3.2 β1-AR激活抑制心衰心室肌細胞IKr的機制

β1-AR主要信號導途徑為 Gs-AC-cAMP-PKA，PKA催化底物蛋白磷酸化［8］。特異性PKA抑制劑KT5720可明顯減弱扎莫特羅對心衰心室肌細胞IKr的抑制作用，提示β1-AR激活部分通過PKA通路抑制心衰心室肌細胞IKr。心衰時β1-AR細胞內信號途徑可能發生轉換，如β1-AR／Ca2+／鈣調蛋白激酶Ⅱ（Ca2+／CaMKⅡ）信號途徑可能起作用。關于CaMKⅡ對鉀電流的調控多集中于IKs電流的研究，對IKr電流研究很少。特異性CaMKⅡ抑制劑KN93對扎莫特羅抑制心室肌細胞IKr的作用無明顯影響，提示CaMKⅡ通路不參與β1-AR對心衰心室肌細胞IKr的抑制作用。

本實驗發現，扎莫特羅對正常和心衰豚鼠心室肌細胞IKr的抑制作用無差異，其原因可能有：（1）心衰時β1-AR下調［4］，扎莫特羅激活 β1-AR抑制 IKr電流作用減弱；（2）心衰時 PKA活性增加［9］，β1-AR激活通過Gs-cAMP-PKA通路抑制IKr電流增強；（3）心衰時細胞內信號機制十分復雜，如Gs-cAMP表達發生變化；其他信號通路，如 A激酶錨定蛋白（AKAPs）［10］通路及 PKC通路等是否參與 β1-AR對IKr電流的調控有待進一步研究。

3.3 β1-AR調控心衰心室肌細胞IKr／hERG通道的臨床意義 IKr通道對維持心臟正常的電生理活動起著重要的作用，在病理狀態下，如心力衰竭，導致hERG／IKr通道功能障礙，心肌細胞復極延遲，動作電位彌散，參與心律失常的發生［11］。心衰患者在運動或情緒激動時，交感神經系統被激活，從而導致局部和循環中兒茶酚胺濃度增高。慢性心衰患者血漿去甲腎上腺素水平達3μmol·L-1，運動時達15μmol·L-1［12］。在心力衰竭及先天性 LQTS患者，運動和情緒的應激激活交感神經系統，興奮心臟α-和β-AR，主要激活β-AR，導致 IKr／hERG電流減少，使復極時間延長，誘發致命性室性心律失常。β1-AR阻滯劑美托洛爾廣泛應用于臨床治療心衰，能減少死亡率和心源性猝死。

本研究發現心衰時β1-AR激活主要通過PKA途徑，抑制心室肌細胞IKr，提示β-AR阻滯劑的抗心律失常作用要部分歸功于它抑制β-腎上腺素對hERG通道的調控。腎上腺素的hERG通道調控是致心律失常的潛在機制，為抗心律失常治療開辟了一個新的途徑。

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