基于UPLC-TOF-MS研究冰片對丹參酮ⅡA在大鼠體內藥代動力學的影響

張璠璠，王宇光，梁乾德，馬增春，湯響林，譚洪玲，肖成榮，趙永紅，高 月

（1.中南大學研究生院，湖南長沙 410000；2.軍事醫學科學院放射與輻射醫學研究所，北京 100850）

丹參為唇形科鼠尾草屬植物丹參的干燥根及根莖。丹參性苦，微寒；歸心、肝經。首載于《神農本草經》，被列為上品，稱其“主心腹邪氣，破散除瘕，止煩滿”，為治療心血管疾病的良藥［1］。臨床上常用于治療月經不調，經閉痛經，瘕積聚，肝脾腫大，心絞痛等疾病［2］。丹參酮ⅡA（tanshinoneⅡA，TS）是從丹參的根中提取分離的二萜醌類化合物，為丹參中的有效成分，具有多種藥理活性，如抗菌、抗氧化、擴張冠狀動脈、增加心肌血流量等功效［3］。復方丹參方是活血化瘀、芳香開竅、理氣止痛的名方，臨床上常用于治療心血管疾病，本研究選擇復方丹參方中使藥冰片和君藥丹參作為研究對象。進一步研究冰片對丹參體內過程的影響，特別是對主要成分丹參酮ⅡA的體內過程影響，有助于探究中藥復方配伍增效的科學性。目前研究多集中于冰片與丹參中水溶性成分的配伍，但脂溶性成分丹參酮ⅡA較少研究，但丹參酮ⅡA是丹參中丹參脂溶性成分含量最大的有效活性成分［4］，也是發揮藥效的重要成分，因此有必要研究冰片對丹參酮ⅡA體內過程的影響，為研究復方丹參方配伍組方的合理性提供體內過程的證據。

冰片是中醫藥中常用的佐藥，具有開竅醒神、清熱止痛、生肌之效。為小分子脂溶性單萜類物質。《本草綱目》言其能“通諸竅”。作為藥引，冰片在許多方劑中起到增加其他藥物的治療效果，即所謂的“芳香走竄，引藥上行”，“獨行則勢弱，佐使則有功”的作用。已有研究顯示，冰片與其他藥物配伍可以提高藥物的生物利用度、促進開放血腦屏障、增加藥物在組織中的分布等［5-7］，目前研究冰片與丹參中水溶性成分的配伍較多，但是冰片與脂溶性成分丹參酮IIA的配伍卻未見報道。本文建立了超高效液相色譜（UPLC）檢測大鼠血漿中丹參酮ⅡA的分析方法，進一步檢測并分析了兩者配伍前后對丹參酮ⅡA藥代動力學行為的影響，以闡明冰片對丹參酮ⅡA藥代動力學的改變與復方丹參方配伍合理性的關系。

丹參酮ⅡA，冰片以及內標物苦杏仁苷的結構式如下：

1 材料

1.1 儀器 Acquity UPLC-Synapt MS色譜-質譜聯用儀（Water公司）、Acquity CSHTMC18色譜柱（100 mm×2.1 mm I.D，1.7μm，Waters公司）、MassLynx V4.1質譜工作站（Water公司）、純水儀（Millipore Simplicity）、冷凍離心機（Heraeus Labofuge 400R）

1.2 藥品與試劑 丹參酮ⅡA標準品（中國食品藥品檢定研究院，批號110766-200619）、冰片（購于安徽綠源公司，經軍事醫學科學院放射醫學研究所馬百平教授鑒定）、乙腈（色譜純，Fisher Scientific公司）、甲酸（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）、甲醇（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）、肝素鈉（江蘇萬邦生化醫藥股份有限公司，批號1207106）。

1.3 動物 SD大鼠♂，體質量（220～250）g，北京維通利華實驗動物公司提供，許可證號SCXK-（京）-2012-0001。

2 方法

2.1 色譜與質譜條件 采用電噴霧電離離子源（ESI），正離子 V模式檢測：m／z范圍為70-1000，毛細管電壓為2.9 kV，錐孔電壓為40 kV，離子源溫度為100℃，脫溶劑溫為450℃，脫溶劑氣體流速為900 L·h-1，錐孔氣流量為50 L·h-1，質量校正質核比為556.2771［8］。流動相為A相0.10%甲酸水溶液，B相為0.10%甲酸乙腈溶液；流速0.40 ml·min-1，柱溫40℃；進樣量為8μl。

2.2 對照品溶液制備 精密稱定丹參酮ⅡA對照品5 mg，甲醇溶解于50 ml容量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，制備成100 mg·L-1對照品儲存溶液。

2.3 血漿樣品制備 取大鼠全血，4 000 r·min-1離心10 min，取上清100μl，加入內標溶液（0.1 mg·L-1苦杏仁苷），混勻，加入乙腈300μl，渦流震蕩10 min，離心 10 min（13 000 r·min-1），取上清 200 μl。

2.4 動物手術 SD大鼠實驗前進行右頸靜脈插管手術，大鼠麻醉后，剃毛，暴露右頸術野，作一5 mm切口。鈍性分離出右頸靜脈，結扎遠心端后作一小切口，插入PE管后結扎固定，導管經頸背部皮下穿出。確保血流通暢后，固定于后背上。術后恢復用于實驗。

2.5 標曲溶液的配制 取大鼠空白血漿100μl，加入丹參酮ⅡA系列標準溶液20μl，配制成相當于濃度為 0.06、0.02、0.01、0.008、0.004、0.002和 0.001 mg·L-1的血漿樣品，按照上述“2.3”項下操作。

2.6 回收率、精密度和穩定性溶液的配制 精密加入空白大鼠血漿100μl及不同質量濃度丹參酮ⅡA對照品，溶液置EP管中，渦旋混合，配制成高、中、低（0.04、0.02、0.01 mg·L-1）3個質量濃度的血漿樣品，按“2.3”項下方法制備樣品。

3 結果

3.1 方法學專屬性 取空白血漿和空白血漿加丹參酮ⅡA對照品溶液，按照分析方法和色譜條件，進樣，得出選擇離子流圖見Fig 1，經比較，空白血漿中的雜質不干擾丹參酮ⅡA的測定，可以用來定量分析。

3.2 標準曲線 以血漿中待測物濃度（C）為橫坐標，待測物與內標物的峰面積之比（Y）為縱坐標，回歸方程為＾Y＝0.5127C-0.0001，r＝0.999，n＝7，丹參酮ⅡA的線性范圍為0.001～0.06 mg·L-1。

3.3 回收率及精密度實驗 平行操作4次，高、中、低平均方法回收率為108.0%、106.5%、101.6%。處理后的樣品置于冰箱中保存，于1 d內進樣，計算高、中、低日內精密度 RSD分別為4.9%，8.0%，5.3%，連續4 d，每天每個濃度進樣1次，計算高、中、低日間精密度分別為3.7%、3.3%、4.6%。

3.4 穩定性實驗 分別考察樣品在室溫條件下放置12、36h，以及-20℃冷凍放置4d期間反復凍融3次的穩定性。結果 RSD分別為：3.7%、1.3%、6.0%，表示穩定性良好。

3.5 丹參酮ⅡA在大鼠血漿中藥物濃度測定結果SD大鼠20只，按體重隨機分為4組，每組5只，實驗前禁食 12 h，不禁水，于給藥后 5、10、15、20、30、45、60、120、180、240、360、720、1440 min從右頸靜脈取血500μl，并同時補充相等體積的生理鹽水，置肝素鈉處理后的離心管中，按“2.3”項下處理、分析。測得平均血藥濃度-時間曲線，見Fig 2、3、4。采用DAS軟件計算大鼠單次口服丹參酮IIA的藥動學參數，結果見Tab 1。

Fig 1 Representative selected reaction monitoring（SRM）chromatograms of plasma sample determined bypresent UPLC-TOF-MS methodA：Blank plasma sample；B：Blank plasma sample spiked with 0.04 mg·L-1 tanshinoneⅡA（Ⅱ）and internal standard（Ⅰ）；C：Plasma sample withrawn at 0.25 h after oral administration 0f TSIIA at a dose of 15 mg·L-1 to a SD rat；Ⅰ ＝Amygdalin，Ⅱ ＝tanshinoneⅡA.

Tab 1 Main pharmacokinetic parameters after oral administration of TsIIA with 0，15，30，and 60 mg·kg-1 borneol in ratsˉx±s，n＝8）

Tab 1 Main pharmacokinetic parameters after oral administration of TsIIA with 0，15，30，and 60 mg·kg-1 borneol in ratsˉx±s，n＝8）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs control（given TsIIA alone）

eters TanshinoneⅡA borneol（0-t） 5.502±1.126 16.141±3.438** 7.895±1.408**0 mg·kg-1 borneol 15 mg·kg-1 borneol 30 mg·kg-1 borneol 60 mg·kg-1 7.508±1.784 AUC（0-∞） 5.97±1.65 16.8±3.799** 8.394±1.747 7.565±1.786 C max 0.009±0.001 0.039±0.004** 0.013±0.002** 0.012±0.002*MRT（0-t） 459.296±81.337 470.666±88.788 460.352±67.805 443.052±68.571 T max 312±107.331 15±0** 228±130 253.333±165.731 CLz 2647.631±618.316 934.916±249.994** 1865.021±474.349 2098.911±605.837 T1 2 z 308.773±139.763 283.81±92.252 286.012±136.173 192.547±23.12 Vz 1089165.7±283857 361684.62±65778.83** 729473.82±273982.76 583963.22±186964.37*

4 討論

藥物的配伍在臨床合理用藥方面有十分重要的意義，對于中藥復方進行體內成分間相互作用及其與增效的關系十分必要。本研究采用的超高效液相色譜／四級桿飛行時間質譜聯用技術，具有超高壓、超高靈敏度、超高分離度、高選擇性等特點，是一種較好的定性定量方法，為目前分析中藥復雜系統有力的工具之一［9-11］。通過研究冰片對丹參酮IIA體內過程的影響來闡述二者的配伍增效規律，為臨床用藥和組方提供實驗依據。Tab 1和Fig 2、3、4中所列，和單獨口服丹參酮IIA相比，在口服15、30、60 mg·kg-1的冰片后丹參酮ⅡA的 AUC（0-T）和 Cmax明顯提高，提示冰片增加了丹參酮IIA的口服吸收，顯示了冰片在復方丹參方配伍增效中扮演重要角色，有助于解釋組方的合理性和科學性。這也為其他中藥復方的配伍提供借鑒和參考。

研究表明，冰片能促進藥物透過血腦屏障、黏膜、皮膚等［12］，主要與其通過影響神經遞質的含量，影響P-糖蛋白的表達，升高一氧化氮（NO）的含量有關，冰片對藥物代謝酶的影響也很大［13］，進而影響其他藥物的吸收，并進一步改變其在體內代謝行為，提高其他藥物的生物利用度，產生復方成分間增效的相互作用。已有的研究顯示冰片具有一定的毒性，如何在發揮冰片增效的同時盡量避免冰片出現毒性反應，就要對冰片在組方中用量進行科學研究，本次研究顯示小劑量15 mg·kg-1時對丹參酮ⅡA具有明顯的增強其生物利用度的作用，更高劑量冰片反而對丹參酮ⅡA的增效作用沒有小劑量明顯，因此促進丹參的生物利用度的同時，盡量減少或降低冰片的用量，對于復方的有效性和安全性更有意義。

本研究顯示丹參酮ⅡA在大鼠體內的藥時曲線呈現不規則的多峰現象，可能與肝腸循環、多部位吸收、藥物在組織分布后的再吸收、藥物制劑的因素、個體差異、血流動力學等因素有關。造成多峰原因可能是一個或多個因素綜合作用的結果［14-15］，這些需要進行組織分布實驗和通過考察肝腸循環現象來確證等。

綜上，本文比較了正常大鼠單獨給予丹參酮ⅡA和與冰片配伍后給藥，丹參酮ⅡA的體內過程，二者均符合非房室模型。丹參酮ⅡA和冰片配伍后，與丹參酮ⅡA單獨給藥比較，丹參酮ⅡA的最高血藥濃度（Cmax）增大，藥-時曲線面積（AUC）明顯增加。提示冰片可促進丹參酮ⅡA的吸收，提高其生物利用度。特別是在冰片低劑量時效果更加明顯，顯示出冰片增丹參之效的配伍特點。

Fig 2 Plasma concentration-time curve of rats after oral administration of TsIIA with 0，15 mg·kg-1 borneol（±s，n＝5）

Fig 3 Plasma concentration-time curve of rats after oral administration of TsIIA with 0，30 mg·kg-1 borneol（±s，n＝5）

Fig 4 Plasma concentration-time curve of rats after oral administration of TsIIA with 0，60 mg·kg-1 borneol（±s，n＝5）

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