GSK-3β活性調(diào)節(jié)與腫瘤治療

陶 麗，盛曉波，劉玉萍，韋忠紅，王愛(ài)云，2，陸 茵，2

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院、2.江蘇省中藥藥效與安全性評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京 210023）

糖原合成酶激酶3（glycogen synthase kinase 3，GSK3）是一種廣泛表達(dá)的絲氨酸／蘇氨酸家族激酶，最初被發(fā)現(xiàn)是參與糖原代謝的關(guān)鍵酶。GSK3包括GSK-3α和GSK-3β兩種亞型，二者高度同源，而后者活性的異常被證實(shí)參與了多種疾病的發(fā)生發(fā)展。GSK-3β基因的編碼產(chǎn)物是含433個(gè)氨基酸殘基和3個(gè)結(jié)構(gòu)域的多功能激酶，ATP綁定在其肽鏈N端，由7個(gè)反向平行的β折疊構(gòu)成的桶狀結(jié)構(gòu)和α螺旋之間，而Arg96、Arg180和Lys205 3個(gè)帶正電的氨基酸組成的口袋結(jié)構(gòu)為底物結(jié)合的核心位點(diǎn)。目前以抑制GSK-3β活性的策略已經(jīng)在糖尿病、雙向情感障礙、阿爾采末病等神經(jīng)退行性疾病中發(fā)揮出積極的臨床效果［1］。但是靶向GSK-3β的腫瘤治療策略卻引發(fā)了強(qiáng)烈爭(zhēng)議［2］。支持者在臨床腫瘤樣本中普遍檢測(cè)出GSK-3β的過(guò)度表達(dá)與活化，無(wú)論是化學(xué)性抑制劑介導(dǎo)的GSK-3β活性下調(diào)，還是干擾RNA介導(dǎo)的表達(dá)沉默均導(dǎo)致腫瘤明顯的生長(zhǎng)抑制［3-4］。

但是另有觀點(diǎn)認(rèn)為，應(yīng)當(dāng)謹(jǐn)慎考慮抑制GSK-3β作為腫瘤治療的用途。原因是β-catenin作為GSK-3β經(jīng)典的磷酸化底物，使得GSK-3β在Wnt信號(hào)通路中充當(dāng)了“腫瘤抑制因子”的功能（Fig 1）。一方面，胞質(zhì)中的GSK-3β作為βcatenin降解復(fù)合物中的開(kāi)關(guān)分子，通過(guò)磷酸化β-catenin及泛素連接酶β-TrCP介導(dǎo)的泛素蛋白酶體通路，使其穩(wěn)定性下降［5］，另一方面細(xì)胞核內(nèi)存在 GSK-3β的分布［6］，但與胞內(nèi)機(jī)制不同，以非磷酸化途徑抑制β-catenin的活性［7］。因此，GSK-3β的失活將在核內(nèi)外啟動(dòng)Wnt信號(hào)途徑，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。相反，上調(diào)GSK-3β的活性可以抑制Wnt信號(hào)從而減少腫瘤的發(fā)生。基于這一理論，某些化合物被證實(shí)可以通過(guò)活化GSK-3β并促進(jìn)β-catenin降解而發(fā)揮抗腫瘤作用［8-9］。

Fig 1 Inhibition of GSK-3βsubsequently causes the activation of Wnt signaling pathway

分析上述兩種觀點(diǎn)的出現(xiàn)，有以下原因：（1）腫瘤組織來(lái)源以及遺傳學(xué)研究策略不一致，得到GSK-3β充當(dāng)促進(jìn)或抑制腫瘤進(jìn)程角色的結(jié)論。如Farago等［10］發(fā)現(xiàn)在正常的小鼠乳腺細(xì)胞上皮中外源性過(guò)表達(dá)激酶失活的GSK-3β時(shí)會(huì)引起乳腺癌的發(fā)生，這一過(guò)程與Wnt活化有關(guān)，從而反對(duì)抑制GSK-3β用于腫瘤治療（從基因到表型）。而Kitano等［11］則通過(guò)比較正常和胰腺癌細(xì)胞株，癌變和非癌變的胰腺組織，發(fā)現(xiàn)GSK-3β活性升高參與了胰腺腫瘤進(jìn)程，從而肯定抑制GSK-3β用于腫瘤治療（從表型到基因）。（2）即使在同一腫瘤細(xì)胞內(nèi)，由于實(shí)驗(yàn)研究的目的不同，也得出相互矛盾的結(jié)論。如Chen和Lan等［12-13］的研究認(rèn)為抑制GSK-3β活性可以抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549的生長(zhǎng)，而Gao等［14］的研究發(fā)現(xiàn)GSK-3β介導(dǎo)了A549細(xì)胞的順鉑耐藥，機(jī)制與Wnt活化有關(guān)，因此認(rèn)為抑制GSK-3β不利于腫瘤治療。通過(guò)以上文獻(xiàn)分析，可以發(fā)現(xiàn)Wnt信號(hào)活化的不良后果始終是抑制GSK-3β的腫瘤治療策略的主要疑慮，因此下文重點(diǎn)介紹GSK-3β活性的轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控對(duì)Wnt信號(hào)的影響以及靶向GSK-3β藥物應(yīng)該采取的新開(kāi)發(fā)策略。

1 GSK-3β活性的轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控對(duì)Wnt信號(hào)的影響

細(xì)胞內(nèi)β-catenin的穩(wěn)定及其核轉(zhuǎn)位作為Wnt信號(hào)通路的標(biāo)志性分子事件，可以直接由Wnt信號(hào)活化配體及其調(diào)節(jié)蛋白激活所致，也可以間接經(jīng)Wnt信號(hào)負(fù)性調(diào)節(jié)機(jī)制失常實(shí)現(xiàn)，而GSK-3β在兩種機(jī)制中均起到了關(guān)鍵性作用［15］。

1.1 GSK-3β磷酸化失活介導(dǎo)的 Wnt活化 目前已知PKA、p70S6K、PKB／Akt、ILK、p90RSK、PKC等上游激酶能夠磷酸化GSK-3β蛋白N端第9位絲氨酸殘基，使得該段保守模序RPRTTSF成為自身激酶區(qū)域的假底物從而封閉了激酶活性。此外，ERK和p38／MAPK分別能夠磷酸化GSK-3β的Thr-43和Ser-389／Thr-390，通過(guò)增強(qiáng)Ser-9磷酸化的易感性也起到了抑制 GSK-3β的作用。而 ZAK1、Fyn、MEK1／2、PYK2、CsK等激酶則能夠磷酸化GSK-3β的Tyr216，通過(guò)穩(wěn)定GSK-3β激酶結(jié)構(gòu)域中的活化環(huán)（activation loop）而增強(qiáng)了GSK-3β活性［16］。氯化鋰（LiCl）是第 1個(gè)發(fā)現(xiàn)的 GSK-3β抑制劑，能夠增加Ser9的磷酸化水平，而對(duì)Tyr216沒(méi)有影響，并作為模擬Wnt活化的常用工具藥［17］。

1.2 Wnt配體介導(dǎo)的GSK-3β失活引起Wnt活化 在7次跨膜的低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白LRP6胞內(nèi)域（1 417至1 613位氨基酸殘基）的Ser／Thr富集區(qū)（GSK-3β綁定位點(diǎn)）下游含有5個(gè)間隔重復(fù)的PPPSPxS模序，能阻斷GSK-3β對(duì) β-catenin的磷酸化（Ser33／Ser37／Thr41），從而起到活化Wnt通路的作用［18］。Wnt配體蛋白首先引起了細(xì)胞膜上卷曲蛋白Frizzled（FZD）及LRP5／6介導(dǎo)的受體異源二聚化，以及LRP6胞質(zhì)域PPPSPxS模序的連續(xù)磷酸化，活化受體則招募散亂蛋白Dishevelled（DVL）至FZD的胞質(zhì)域，同時(shí)DVL又能夠吸引胞質(zhì)內(nèi)軸蛋白Axin與之作用，并將原先β-catenin破壞復(fù)合體中的GSK-3β隨之綁定于LRP6的Ser／Thr富集區(qū)，并與膜錨定的酪蛋白激酶CKIα共同催化該處Ser／Thr的磷酸化，而FZD與Axin的結(jié)合也更加緊密。因此磷酸化的LRP6胞質(zhì)域PPPSPxS模序隔離了結(jié)合在上游Ser／Thr富集區(qū)的GSK-3β活性，從而失去了磷酸化β-catenin的作用而增強(qiáng)了 β-catenin的穩(wěn)定性［19］。

1.3 GSK-3β的亞細(xì)胞定位和存在形式對(duì)Wnt活化的影響

理論上，當(dāng)調(diào)控GSK-3β活性的上游激酶對(duì)其造成的抑制作用將伴隨Wnt的組成性活化。但是，因PTEN缺失或各種因子介導(dǎo)的PKB／Akt信號(hào)持續(xù)性激活的腫瘤細(xì)胞并不表現(xiàn)為基礎(chǔ)水平的Wnt活化［20］。研究認(rèn)為GSK-3β以多種形式存儲(chǔ)在細(xì)胞中（GSK-3βpool），而 Axin-GSK-3β復(fù)合物中的GSK-3β則不會(huì)受到Akt活化的影響，Axin則被認(rèn)為是將GSK-3β隔離，從而免受其他橋接信號(hào)通路的干擾而只在Wnt中發(fā)揮作用的神盾［21］。在另一項(xiàng)研究中，Taelman等［22］證實(shí)Wnt信號(hào)可啟動(dòng)GSK-3β從胞質(zhì)向多泡內(nèi)含體（multivesicular endosomes）內(nèi)轉(zhuǎn)移，從而使其與 β-catenin降解復(fù)合體徹底分離，導(dǎo)致β-catenin半衰期延長(zhǎng)。因此，細(xì)胞生物學(xué)的絕緣（insulation）機(jī)制保障了GSK-3β在參與多條信號(hào)通路中避免在功能上發(fā)生錯(cuò)亂（Fig 2）。

Fig 2 Compartmentalization of GSK-3βin Wnt and PKB／Akt signaling pathways

2 GSK-3β的底物競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑開(kāi)發(fā)

作為激酶家族的一員，ATP結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)性的小分子抑制劑是目前以GSK-3β為靶點(diǎn)開(kāi)發(fā)的化學(xué)藥物的主要品種。但該類(lèi)藥物以與其他激酶抑制劑相同的機(jī)制抑制了GSK-3β的活性，使得這些既依賴于激酶活性又在功能上隔離的酶分子受到普遍抑制，不可避免導(dǎo)致了副作用的發(fā)生［23］。GSK-3β具有多達(dá)數(shù)百個(gè)的催化底物，對(duì)下游的精確調(diào)控決定了細(xì)胞在死亡和存活之間的動(dòng)態(tài)平衡［24］。因此，提高選擇性是GSK-3β抑制劑開(kāi)發(fā)的關(guān)鍵，目光應(yīng)當(dāng)轉(zhuǎn)向非ATP競(jìng)爭(zhēng)型抑制劑設(shè)計(jì)的思路中去。針對(duì)腫瘤中功能異常的某些底物，采用底物結(jié)合部位競(jìng)爭(zhēng)性抑制的研發(fā)思路（substrate competitive approach），已成為實(shí)現(xiàn)選擇性靶向GSK-3β高效低毒型抑制劑開(kāi)發(fā)的最佳策略［25］。

在此，必須認(rèn)清GSK-3β不同于其它激酶的催化機(jī)制：GSK-3β的絕大多數(shù)底物需要先被另一種激酶預(yù)磷酸（prephosphorylation）化后，才能被GSK-3β催化。如GSK-3β磷酸化β-catenin時(shí)，需要CKIα預(yù)先對(duì)其Ser45進(jìn)行磷酸化。其底物一般具有S1XXXS2（p）的特殊基序，S為絲氨酸，S1是GSK-3β的磷酸化位點(diǎn)，而其下游第4個(gè)氨基酸處的S2（p）為預(yù)磷酸化位點(diǎn)［16］，因此設(shè)計(jì)類(lèi)似底物序列的預(yù)磷酸化模擬肽可以對(duì)天然底物產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用，從而可以選擇性猝滅GSK-3β對(duì)該底物的催化活性及其下游效應(yīng)。

Licht-Murava等［26］開(kāi)發(fā)出一種膜滲透性的熱休克蛋白-1（HSF-1）預(yù)磷酸化多肽序列L803-mts，能在體內(nèi)外很好地抑制GSK-3β活性并應(yīng)用于阿爾采末病的治療中。而Kim等［27］最近創(chuàng)新性地設(shè)計(jì)出了一種Akt活化依賴的GSK-3β抑制性嵌合多肽，該多肽利用磷酸化的LRP6模序PPPSPXS對(duì)GSK-3β的抑制作用，將其與GSK-3β蛋白N端的Akt磷酸化模序RxRxxS相連接（LRP-GSK），并根據(jù)GSK-3β對(duì)底物預(yù)磷酸化位點(diǎn)的要求，經(jīng)Akt觸發(fā)肽鏈內(nèi)部的磷酸化級(jí)聯(lián)，最終傳遞到PPPSPxS模序中的兩個(gè)絲氨酸，前者被GSK-3β磷酸化，后者則被CKIα磷酸化，最終導(dǎo)致GSK-3β活性的強(qiáng)烈抑制。因此該嵌合肽可以應(yīng)用到Akt高度活化或者經(jīng)上游因子啟動(dòng)的Akt激活模型中，選擇性響應(yīng)Akt信號(hào)并介導(dǎo)GSK-3β失活，同時(shí)該肽段由于缺少LRP6的Ser／Thr富集序列，故不會(huì)對(duì)Wnt信號(hào)中的GSK-3β造成影響，因此極大程度地減少了副作用的發(fā)生。

因此，底物特異的GSK-3β競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑開(kāi)發(fā)似乎不再依賴于傳統(tǒng)的三維晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行虛擬篩選和藥物設(shè)計(jì)，并從小分子化合物的高通量篩選中徹底解放出來(lái)，而是基于生物網(wǎng)絡(luò)調(diào)控背景下GSK-3β活性調(diào)控機(jī)制的藥物研發(fā)模式。

3 討論與展望

作為一種復(fù)雜的多功能激酶，GSK-3β在不同類(lèi)型、發(fā)展階段、遺傳背景的腫瘤及不同的亞細(xì)胞部位中分別發(fā)揮著不同的功能，因此需要鑒定在不同狀態(tài)的腫瘤中GSK-3β主要執(zhí)行的是促瘤還是抑瘤因子的功能，采取聯(lián)合治療的措施，增強(qiáng)其抑瘤因子的作用或削弱其促瘤因子的作用或兩種策略同時(shí)進(jìn)行，從而最終向著抑制腫瘤的目標(biāo)發(fā)展。如GSK-3β對(duì)于維持腫瘤NF-κB活性的關(guān)鍵性作用已獲得各界肯定，在表現(xiàn)NF-κB高度活化的腫瘤病人中，GSK-3β抑制劑能增強(qiáng)腫瘤化療和放療的敏感性［28］。此外，Wnt通路的激活需要細(xì)胞內(nèi)近75%-80%的GSK-3β發(fā)生失活，因此原則上如果找到部分抑制GSK-3β發(fā)揮抗腫瘤作用，同時(shí)又不足以激活Wnt的劑量范圍，無(wú)疑為傳統(tǒng)的化學(xué)抑制劑的抗腫瘤臨床應(yīng)用保留了余地［29］。另一方面，仍需深入了解GSK-3β活性調(diào)節(jié)的絕緣機(jī)制，通過(guò)底物競(jìng)爭(zhēng)的方式選擇性干擾GSK-3β介導(dǎo)的某種信號(hào)系統(tǒng)的功能而不對(duì)其他系統(tǒng)造成影響，最大程度保障用藥的安全性和有效性。綜上，研究GSK-3β的活性調(diào)節(jié)機(jī)制在腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用顯得尤為迫切，這為靶向GSK-3β腫瘤治療藥物的研發(fā)提供了新的思路。

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