簡易冠狀動脈結扎法制作大鼠心肌梗死模型方法的探討

周 敏，章 薇*，李成文，陳 成，李 里，潘 江（.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 4008；.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南 長沙 40007）

·基礎研究·

簡易冠狀動脈結扎法制作大鼠心肌梗死模型方法的探討

周 敏1，章 薇2*，李成文1，陳 成2，李 里2，潘 江2
（1.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南 長沙 410007）

目的 探討大鼠心肌梗死模型簡易構建的方法。方法 將大鼠麻醉，氣管插管連接呼吸機后結扎左冠狀動脈前降支制作心肌梗死模型，于術后7 d處死，取出心臟觀察心臟外形，TTC染色后觀察心梗范圍。結果 85只大鼠用于心肌梗死模型的制作，存活80只，根據術中所見、心電圖及術后TTC等檢測確定有心肌梗死。結論 該方法制作大鼠心肌梗死模型的方法簡易，且存活率較高，降低了大鼠冠脈結扎后的死亡率，為心肌梗死的基礎研究提供了另一種簡易的模型制作方法。

心肌梗死；大鼠模型；心電圖；冠狀動脈結扎

近年來，冠心病嚴重威脅人類健康，已占我國心血管病總發病數的65%[1]，并呈現逐年上升且低齡化趨勢[2]。據WHO預測，到2030年冠心病將成為威脅人類健康的第二大疾病[3]。標準化的動物模型是實驗研究的基礎。當前，心肌梗死模型的制作方法很多[4]，如冠脈結扎法、冠脈夾閉法、微量直流電刺激法、藥物注射法、冷凍法、電凝法等，但冠狀動脈結扎法為目前認為最貼近心肌梗死生理狀態的方法。但傳統的冠脈結扎法存活率較低，從而加大了實驗的難度，本實驗采用一種簡易實驗方法，簡化實驗操作，提高造模動物存活率，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 SD大鼠85只，雄性，體質量為（220± 10）g，由湖南中醫藥大學動物實驗中心提供，動物實驗合格證號:43004700005441，動物實驗許可證號: SCXK(湘):2013-004。

1.1.2 主要試劑與試藥 紅四氮唑 （TTC）（北京福星化工廠）；多聚甲醛、水合氯醛（長沙唯爾生物科技有限公司生物試劑經營部）；硫酸阿托品注射液（河南淘弘制藥股份有限公司）；注射用青霉素鈉（華北制藥股份有限公司）。

1.1.3 主要儀器 小動物呼吸機RWD407（深圳市瑞沃生命科技有限公司）；BL-420F生物機能實驗系統（成都泰盟科技有限公司）。

1.2 方法

采用10%水合氯醛，按0.3 mL/100 g腹腔注射麻醉大鼠，將麻醉好的大鼠捆于鼠板上，連接生物機能實驗系統（小動物心電圖機），記錄術前大鼠心電圖情況。予以阿托品0.05 mL腹腔注射，大鼠頸部及左前胸部消毒備皮后，于胸骨上窩前正中線處切開0.5~1 cm的縱形切口，依次鈍性分離氣管周邊組織，采用60 mL注射器針頭連接呼吸機軟管，于第2、3環狀軟骨間進行插管，角度要小，以防穿破下層氣管，進針約5 mm左右即可，呼吸機設置為容量控制模式，潮氣量為1.25 mL，呼吸頻率為75 次/min。輔助呼吸連接好后，用指尖觸心尖搏動最強區，一般位于第4-5肋間，手術區碘伏消毒后于胸骨左緣旁開約1 cm作一縱形切口，切口上下端不超過胸骨上下端，長度約2 cm，而后鈍性分離胸部肌肉，分別用4-0縫合線將分離出來的肌肉穿線（折雙折）拉開并固定于鼠板上以暴露肋骨，于第4-5肋間鈍性分離肋間肌，并在第4、5肋骨各掛1根4-0縫合線，拉開2肋骨并將線固定于鼠板上，以充分暴露手術視野，撕開胸膜，用小紗布沾生理鹽水后將肺壓向左側胸腔，以防結扎時損傷肺葉，撕開心包膜，左手中指于大鼠右側胸腔稍用力往左推，右手持持針器于左心耳下緣2 mm入針，穿過左心耳與肺動脈圓錐的交界，寬度約4 mm，深度約2 mm，以5-0帶線縫合針結扎冠狀動脈左前降支。結扎后即刻記錄大鼠心電圖，心電圖標準肢體II導聯ST段抬高（≥0.1 mV）作為結扎成功的標志（見圖1）。完成心電圖后，取出小紗布后立即關胸，完全閉合前，胸腔內置入頭皮針的塑料吸管，連接20 mL注射器，完全閉合后，一邊抽吸一邊稍稍移動胸腔內的吸管，給胸腔造成負壓，待心率明顯加快后才可取出。采用連續縫合法縫合肌肉，在最后打結之前，用注射器連接軟管再次抽空肌肉內的氣體，直至肌肉緊貼肋骨為止，最后縫合皮膚，完成關胸，并觀察心電圖，待心電圖平穩后拔出氣管插管并縫合皮膚。術后大鼠腹腔內注入8萬U青霉素，連續3 d，預防感染，并取右側臥位置于單籠喂養，上方置以臺燈保溫。

1.3 心肌梗死模型的鑒定

1.3.1 心電圖檢查[4]冠脈結扎后即刻記錄大鼠心電圖，心電圖標準肢體II導聯ST段抬高（≥0.1 mV）作為結扎成功的標志。

1.3.2 TTC染色 術后7 d處死大鼠，取出心臟，做TTC染色進行觀察。

2 結果

本實驗納入SD大鼠85只，采用左冠狀動脈前降支結扎法制作大鼠心肌梗死模型，術前因麻藥原因死亡1只，術中因結扎過深致大出血死亡1只，術后因胸腔關閉不全死亡2只、呼吸道分泌物窒息死亡1只，成功完成心肌梗死造模80只，冠脈結扎后即刻行心電圖檢查，可見心率較快，約300次/min，ST段上移（見圖1），提示心肌梗死模型成立。心肌梗死模型制作的成功率為94.12%。術后7 d取材，肉眼觀察大鼠心臟缺血區的室壁變薄局部凹陷，顏色較周圍的心肌淺，心室壁薄（見圖2）。大鼠心肌TTC有明顯改變，缺血區著色變淺（見圖3）。

圖1 大鼠冠脈結扎前后心電圖

圖2 心肌梗死大鼠冠脈結扎后心臟直觀圖

圖3 心肌梗死大鼠心臟TTC染色直觀圖

3 討論

冠狀動脈前降支結扎法是心肌梗死造模的常用方法，為目前認為最貼近心肌梗死生理狀態的方法，但因其操作繁瑣，制造模型用時較長，其死亡率較高[6]，成功率僅為20%，增加了實驗的難度。本實驗通過改進以下兩個關鍵步驟，提高造模成功率。

3.1 簡化實驗步驟，縮短操作時間

3.1.1 氣管插管 本實驗采用60 mL注射器針頭連接呼吸機軟管后快速進行氣管插管，一方面能減少因剪開氣管所致分泌物增多而增加其窒息可能，另一方面快速一針插管可節省其操作時間。

3.1.2 開胸及關胸 本實驗開胸時以縫合線替代牽開器，一方面能擴展手術視野，利于手術結扎操作，另一方面能避免牽開器對肺的損傷，同時，牽拉的縫合線在關胸時可即刻使用，無需另外穿針引線，節省實驗時間。

3.2 造模成功相關因素的探討

3.2.1 開胸時間 本實驗發現，開胸時間長短與造模后動物存活率呈負相關，開胸時間越短，動物存活率越高。本實驗通過簡化實驗步驟，減少實驗用時，提高大鼠存活率。

3.2.2 胸腔負壓 胸腔負壓的形成是保證關胸后大鼠能否恢復自主呼吸非常關鍵的一步，實驗中發現，如若抽氣未完全，則大鼠關胸撤離呼吸機后，立刻死亡。本實驗在縫合第4、5肋骨時，置入一輸液軟管，連接注射器，最后關閉胸腔時，必需要回抽胸腔氣體，造成胸腔負壓。此外，為了進一步確保胸腔處于負壓狀態，連續縫合肌肉后，最后結扎前，置入一軟管，抽吸空氣至肌肉完全貼合肋骨。

3.2.3 呼吸的恢復 大鼠術后呼吸恢復與否直接影響造模成功率。手術期間因使用麻醉藥及氣管插管刺激可致氣管分泌物較多，易造成動物窒息死亡。本實驗使用注射器針頭進行穿刺可以減少因剪開氣管或反復軟管插管而對氣管造成的刺激，從而能有效減少氣管內分泌液。術前予以阿托品腹腔注射，可有效減少因麻醉藥而致的腺體分泌過多，此外，胸腔負壓的恢復，利于術后動物自主呼吸的恢復。

實驗操作重在細節的把握，冠狀動脈結扎法制作心肌梗死模型是經典造模方法，本實驗通過簡化相關步驟，注重實驗細節，密切關注模型大鼠的呼吸、心率的恢復，從而提高模型動物存活率。使冠脈結扎的方法更簡單易行，為心肌梗死的基礎研究提供了另一種簡易的實驗方法。

[1]武陽豐，周北凡，李 瑩，等.缺血性心血管病:一個反映血脂異常潛在危險的新指標[J].中華心血管病雜志，2004，32(2):173-176.

[2]Liem DA，Honda HM，Zhang J，et at.Past and present course of cardioprotection against che-mia-reperfusion injury[J].J Appl Phvsiol，2007（103）:2 129-2 136.

[3]Datta R，Oki E，Endo K.et al.XIAP regulates DNA damageinduced apoptosis downstream of caspase-9 cleavage[J].J Biol Chem，2000，275(41):31 733-31 738.

[4]盧志強，張艷軍，崔廣智，等.心肌缺血模型的制作方法研究進展[J].中國藥理學通報，2012，28(8):1 053-1 057.

[5]趙洪云，管慧紅，鐘雪云，等.開胸冠狀動脈結扎法制作大鼠心肌梗死模型[J].國外醫學·內科學分冊2005，32(12):540-542.

（本文編輯 楊 瑛）

Discussion on the Simple Method for Myocardial Infarction Model Rats by Coronary Artery Ligation

ZHOU Min1,ZHANG Wei2*,LI Chengwen1,CHEN Cheng2,LI Li2,PAN Jiang2
(1.Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,China; 2.The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410007, China)

ObjectiveTo discuss the simple establishment method for cardiac ischemic model rats.MethodsThe rats were anesthetized,followed by tracheal intubation with artificial ventilation. Then the myocardial infarction models were produced by ligating the left coronary artery.The rats were killed at 7 days after operation.The heart was taken out to observe the shape,measure the range ofmyocardialinfarction by TTC staining.Results85 rats were builtformyocardial infarction models,and 80 survived.80 rats with myocardial infarction were confirmed by operative observation,electrocardiogram and TTC.ConclusionThis method for cardiac ischemic models is simple and with high survival rate,it also can reduce the death rate after the operation.Thatprovided an additional simple method for models.

myocardial ischemia;rat models;electrocardiogram;coronary artery ligation

R543.3，Q95-33

B

doi:10.3969/j.issn.1674－070X.2014.12.001.001.03

2014－08－23

國家自然科學基金項目（81273861）；湖南省自然科學基金項目（11JJ5078）；湖南省科技廳科技計劃課題（2012FJ4361）。

周 敏，女，在讀碩士研究生，主要從事針灸治療機制的研究。

*章 薇，女，教授，主任醫師，博士研究生導師，E-mail:507395550@qq.com。