基于氣相色譜—質譜聯用技術的結核性腦膜炎患者腦脊液代謝組學觀察

劉炳祥，歐 強

(1上海市閘北區中心醫院，上海200070;2上海市浦東醫院)

結核性腦膜炎(簡稱結腦)病情兇險，病死率和致殘率極高，其預后與早期診斷、及時治療密切相關［1，2］。代謝組學是后基因組時代的一個重要研究領域，通過比較刺激前后或不同病理生理狀態下的代謝圖譜，能夠揭示疾病發生發展的代謝機制，發現和篩選生物標志物，并為進一步探索治療靶點提供有用信息［3～7］。2009年12月 ～2012年12月，我們采用氣相色譜—質譜聯用技術(GC-MS)觀察了結腦患者腦脊液代謝組學的變化。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 診斷標準:①有典型的結腦臨床表現和CSF改變，臨床抗結核治療有效;②CSF涂片抗酸桿菌陽性，或結核桿菌培養陽性，或結核桿菌DNA PCR擴增陽性。選擇符合上述診斷標準的結腦患者15例(結腦組)，其中男11例、女4例，年齡(46.0±7.8)歲。另選擇需腰麻的外傷手術患者14例(對照組)，排除中樞神經系統感染性疾病，其中男10例、女4例，年齡(44.1±8.5)歲。兩組年齡、性別具有可比性(P均＞0.05)。

1.2 方法

1.2.1 樣品制備 采集兩組的 CSF 1 mL，4℃下8 000 r/min離心10 min，－80℃保存備用。取CSF樣品100μL，加入300μL冷HPLC級乙腈/甲醇的混合溶液(ACN∶MeOH=1∶1;v/v);渦旋混合2 min后，于4℃下靜置10min，14 000 r/min離心15min;取上清液250μL于GC小瓶(離心管)中，減壓揮干溶劑。

1.2.2 GC-MS分析 本實驗的儀器分析平臺為Agilent7890A GC/5975C MS系統。衍生化步驟:加入75∶1甲氧胺吡啶溶液(15 mg/L)，渦旋lmin后密閉，70℃下放置1 h;加入75μL三甲基硅烷化試劑(MSTFA∶TMCS=100∶1，v/v)，渦旋后密閉，室溫下反應1 h。樣品衍生化后再加入150μL正庚烷稀釋，混勻后離心，取上清液進行GC-MS分析。GCMS分析測試參數設置:進樣口溫度270℃，離子源溫度230℃，四極桿溫度150℃，質譜檢測范圍60～600 m/z，載氣 He(0.8 mL/min)，進樣量 0.2 μL，不分流進樣。全掃描形式進行質譜檢測，譜峰檢測和重疊峰分辨分別使用MSDchem和NIST08軟件，NIST質譜數據庫提供化合物檢索和指認。升溫程序:初始溫度70℃，保持5 min;以10℃/min的速度升至100℃，保持5 min;以10℃/min的速度升至200℃，保持5 min;以100℃/min的速度升至300℃，保持10 min。

圖1 兩組CSF經GC-MS分析后的TIC

1.2.3 模式分析 在R軟件平臺下采用自寫的程序代碼提取原始數據信號，導入TagFinder軟件進行保留時間校正、峰對齊和碎片歸屬分析，所有參數均為缺省設置。在EXCEL軟件中進行后期編輯，將結果組織為二維數據矩陣，包括變量、觀察量(樣本)和積分面積。最后將數據導入到Simca-P11.0商業軟件中進行非監督主成分分析(PCA)［8］和有監督的正交偏最小二乘方判別分析(O-PLS-DA)，模型驗證參數為R2Y、Q2，R2Y代表模型可解釋的變量，Q2代表模型的可預測度，R2Y、Q2高于0.5即認為該模型穩定可靠。

1.2.4 統計學方法 采用SPSS12.0統計軟件。數據采用±s表示，選擇較優的模式分析兩組主成分的重要性因子(VIP)值，進行t檢驗。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組GC-MS分析結果 兩組CSF經GC-MS分析后，得到代表性總離子流圖(TIC)，見圖1。

2.2 PCA和O-PLS-DA分析結果 采用PCA分析共得到6 個主成分，R2Y=0.783，Q2=0.675;采用 OPLS-DA分析共得到1個主成分和1個正交成分，R2Y=0.935，Q2=0.887;O-PLS-DA 方法的 R2Y 和 Q2參數值均高于PCA，提示O-PLS-DA要優于PCA。

2.3 兩組CSF差異代謝物分析結果 根據保留時間和片段鑒定代謝產物，搜索NIST商業數據庫定性差異性代謝物。根據GC-MS的TIC中各峰保留時間選擇共有峰，用相對峰面積(各峰與內標峰的比值)來表示代謝物水平，以判斷變化趨勢。與對照組比較，結腦組CSF中的代謝物表達下調10個(L-蘇氨酸、來蘇糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、十二烷酸、十六烷酸、十八烷酸、單棕櫚酸甘油、十八酸甘油酯)，表達上調1個(山梨醇)，見表1。

表1 兩組CSF差異代謝物分析結果

3 討論

代謝物居于基因和蛋白質的下游，其水平變化可以說明生物體對外源刺激和病理變化的綜合應答［9］。通過模式識別方法分析機體在不同狀態下的代謝表型和代謝動態變化，可以更好地了解病變過程及機體內物質的代謝途徑和作用機制［10］。GCMS是當前最為活躍的聯用技術，具有很好的分離效率，可由計算機對MS圖譜進行化合物數據庫的自動檢索核對，有利于迅速鑒識樣品［11，12］。我們運用GC-MS技術，對結腦和正常對照者CSF樣本進行檢測，通過對檢測到的代謝物離子及其相對含量進行多元統計學分析，建立了基于模式識別技術的代謝輪廓聚類區分模型。

本試驗發現，結腦患者CSF中來蘇糖、葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖水平均有不同程度下降，提示結腦患者糖代謝發生嚴重紊亂。推測可能為結核桿菌破壞了腦膜細胞，損傷的腦膜細胞釋放出葡萄糖酵解酶，促進了糖酵解過程，使得CSF中糖含量降低。同時一些炎癥細胞的代謝產物抑制了血腦屏障的膜攜帶運轉功能，使血糖向腦脊液運轉發生障礙，導致腦脊液糖含量減少。臨床上關注并監測CSF中這類物質，可能有利于輔助診斷和評估病情。

L-蘇氨酸是一種必需的氨基酸，參與構成機體免疫系統，是動物免疫球蛋白分子中的主要氨基酸之一。缺乏蘇氨酸會抑制免疫球蛋白和T細胞、B細胞及其抗體的產生。在炎癥性疾病發生時，機體對蘇氨酸的需求增加，用于合成急性反應蛋白。結腦患者CSF中L-蘇氨酸顯著降低，提示結腦患者氨基酸代謝紊亂。推測可能是機體炎癥反應加劇，蘇氨酸大量參與抗氧化作用，導致消耗增加。故密切關注蘇氨酸的動態變化，對于了解病情具有非常重要的作用。有研究發現，補充蘇氨酸能夠滿足由感染所致氨基酸需求的增加，減少肌肉蛋白的降解［13］。臨床上對蘇氨酸水平顯著下降的結腦患者應積極給予補充，加強營養支持治療。

累積的山梨醇直接產生神經毒性作用，影響蛋白激酶活性，使 Na+-K+-ATP酶轉運Na+和K+的能力減弱，細胞膜去極化受阻，細胞內滲透壓增高，細胞腫脹、變性、壞死，從而導致神經細胞膜結構和功能的完整性受損，出現神經病變［14］。結腦患者CSF中山梨醇水平升高，可能與多元醇代謝通路異常活躍有關。本研究還發現，結腦患者CSF中十二烷酸、十六烷酸、十八烷酸、單棕櫚酸甘油及十八酸甘油酯水平較正常人顯著降低，提示結腦患者脂肪酸代謝出現紊亂，其確切機制尚待進一步研究。

總之，本研究采用GC-MS對結腦患者CSF代謝輪廓進行了研究，發現了一些與結腦相關的特征代謝物，可以從分子水平更好地認識結腦的發生機制，為其診斷和治療靶點提供可靠的分子水平上的代謝證據。

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