不同時期條紋環溝藻可培養藻際細菌研究

王 劍,王朝暉,熊毅俊 (暨南大學生態學系,水體富營養化與赤潮防治廣東普通高校重點實驗室,廣東 廣州510632)

在微藻周圍聚集了以細菌為主的大量微生物,微生物與藻細胞及其胞外分泌物所形成的特殊環境被稱為“藻際環境”,藻際環境中的細菌稱為藻際細菌,是一個具有特殊結構和功能的群體

[1].在藻類生長的不同時期以及浮游植物群落變動過程中,藻際細菌密度和群落結構均會發生變化[2].而且不同藻類的藻際細菌也具有種間特異性[3-4],如亞歷山大藻屬(Alexandrium)中的不同種類藻際細菌組成有所不同[5-6].目前已經證實一些赤潮藻類的藻際細菌具有殺藻作用[7],而且在赤潮藻消亡過程中,溶藻細菌密度增加[3,8-9].因此,藻際細菌可能在赤潮生消過程中起著重要的調控作用[10].

條紋環溝藻(Gyrodinium instriatum)是珠江口常見的赤潮生物,曾多次在珠江口引發赤潮[11-13];在國外,僅在日本和厄瓜多爾報道了條紋環溝藻赤潮的發生[14-15].本研究對條紋環溝藻不同生長時期的藻際細菌進行了分離培養,通過16S rDNA V3區序列測定與對比對細菌進行了分子分類鑒定,同時分析了藻細胞不同時期細菌的群落結構和豐度變化,以揭示條紋環溝藻不同生長時期藻際細菌群落結構的變化,為進一步了解藻際細菌在條紋環溝藻赤潮生消過程中的作用提供參考.

1 材料與方法

1.1 藻種來源與其培養

實驗藻種為條紋環溝藻,為2009年珠江口赤潮期間分離培養得到的單細胞培養株.藻種馴化培養和擴大培養采用 f/2培養基.培養基所用的人工海水由 Instant Ocean牌海鹽配制,鹽度為32,pH 值為 7.9±0.1.配制的人工海水經孔徑為0.25μm的混合纖維濾膜過濾滅菌后,添加營養元素備用.培養溫度為 20℃,光照強度為 100μmol/(m2˙s),光暗比為 L:D = 12h:12h.

1.2 藻細胞生長曲線的測定

將處于對數生長期的藻細胞轉接至 250mL三角瓶中,初始接種密度為 390cells/mL,藻細胞培養條件同 1.1,實驗設置 3個平行.培養時間為38d,每隔2d取1.5mL的培養液測定葉綠素熒光值,根據葉綠素熒光與細胞密度的關系(y=3.3594x+48.308,R2=0.9998,其中y為葉綠素熒光值,x為藻細胞數量)計算細胞數量.

1.3 藻際細菌的分離培養

在環溝藻生長周期中選取 5個時期,在無菌條件下,吸取 1mL藻細胞培養液,用梯度稀釋法進行稀釋,稀釋的倍數為 10-1～10-6,吸取 10-3～10-6的4個梯度稀釋液100μL均勻涂布于2216E固體培養基培養皿中,培養皿置于28℃恒溫培養箱培養.培養5～7d后對不同形態的單菌落進行分離純化培養2～3次.

1.4 單菌落16S rDNA V3區的PCR擴增與分子鑒定

用滅菌的牙簽挑取單菌落于含 100μL去離子水的離心管中,沸水浴 7min,-20℃ 7min,反復融凍循環3次后,10000r/min離心10min,吸取上清液 4μL作為 PCR模板.采用原核生通用引物341F (5′-CCTACGGGAGGCAGCAG-3′) 和907R (5′-CCGTCAAATCMTTGAGTTT-3′)對細菌rRNA基因16S V3區的保守序列進行PCR擴增.擴增體系為 30μL,擴增體系中各組分含量為別為:10×buffer 3μL,dNTP 1μL,上下游引物各0.3μL,rTaq DNA 聚合酶 0.4μL,DNA 液 4μL,ddH2O 21μL.PCR 擴增反應程序為:95℃ 4min,35×(95℃ 30s,57℃ 30s,72℃ 40s),72℃ 7min,4℃+∞.擴增產物用1%瓊脂糖凝膠進行檢測.

PCR擴增產物由深圳華大基因科技有限公司測序,測序長度在550bp左右.測序獲得的序列在 NCBI上通過BLAST比對,在 GenBank上下載同源性最高的 16S rRNA序列.菌株間的相似度大于等于97%表示相同的種,在93%～97%間表示相同的屬,小于93%表示不同的屬[16].

1.5 系統發育樹的構建

在GenBank上下載同源性最高的16S rDNA V3區序列,用 Clustalx2.0軟件包進行比對,用MEGA 5.0進行系統發育分析,計算遺傳距離,遺傳距離小于0.046屬于種內差異;0.046～0.06為種間屬內差異[17-18].根據Kimura 2參數法計算進化距離,構建N-J系統樹,自舉值(bootstrap)為1000.

1.6 可培養細菌菌落結構分析

選擇合適菌落個數(30～300)的培養皿,計數不同細菌的菌落數,根據培養皿接種的稀釋倍數即可得到1mL藻液中細菌總數.

將細菌數量取自然對數后,用 spss19.0軟件采用多維尺度分析法和組間聯接的聚類分析法對藻細胞不同生長時期的群落結構進行分析.

2 結果與分析

2.1 條紋環溝藻的生長曲線

圖1為條紋環溝藻的生長曲線,在經歷了3d的延滯期后,藻細胞進入了對數生長期,對數增長一直維持到第 18d,隨后是短暫的穩定生長期,很快細胞密度迅速下降.分離培養藻際細菌的 5個時期,時期Ⅰ為延滯期,時期Ⅱ為對數生長中期,時期Ⅲ為穩定生長期,時期Ⅳ衰亡前期,時期Ⅴ為衰亡后期.

圖1 條紋環溝藻的生長曲線Fig.1 The growth curve of Gyrodinium instriatum標注了細菌培養取樣的5個時期

2.2 條紋環溝藻藻際細菌的分子鑒定

在條紋環溝藻的 5個不同時期總共分離出32株細菌,經過16s rDNA V3區序列測定,去除重復序列,共得到菌株 12株不同的菌株,編號為Gi-1～Gi-12,GenBank序列登錄號為 KF444158-KF444169.條紋環溝藻中分離的可培養細菌分為α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)、γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和放線菌門(Actinobacteria)4大類(表 1),12株細菌中6株屬于α-變形菌綱,3株γ-變形菌綱,2株屬于擬桿菌門,1株屬于放線菌門.

根據不同菌株與GenBank上已知序列的相似度(表 1),可以得出 Gi-2、Gi-3以及 Gi-5～Gi-8這6株細菌屬于α-變形菌綱.其中Gi-2沒有與之相似的同種或同屬的細菌,僅與紅螺菌屬的一個序列(Rhodospirillumsp.,NC007643)相似度為90%,已經超出了屬間差異[16],因此為α-變形菌綱某個種;Gi-3與Erythrobacter litoralis(NC007722)相似度為 99%,可認為是Erythrobacter litoralis;Gi-5與反硝化玫瑰桿菌(Roseobacter denitrificans,NC008209)相似度為98%,可認為是反硝化玫瑰桿菌;Gi-6與一株魯杰氏菌屬(Ruegeriasp.,NC008044)相似度為 99%,可認為屬于魯杰氏菌屬;Gi-7與Polymorphum gilvum(NC015259)相似度為 99%,可認為是Polymorphum gilvum;Gi-8與Phaeobacter gallaeciensis(NC018286)相似度為 97%,可認為是Phaeobacter gallaeciensis.

屬于γ-變形菌綱的3株菌株分別是Gi-1、Gi-4、Gi-12,其中 Gi-1與麥氏交替單胞菌(Alteromonas macleodii,NC011138)序列相似度為99%,可認為是麥氏交替單胞菌;Gi-4與Marinobacter adhaerens(NC017506)相似度為97%,可認為是Marinobacter adhaerens;Gi-12與鮑氏不動桿菌(Acinetobacter baumannii,(NC017847)相似度為 97%,可認為是鮑氏不動桿菌(Acinetobacter baumannii).

Gi-9和 Gi-10屬于擬桿菌門,Gi-9與Robiginitalea biformata(NC013222)相似度為92%,Gi-10與Gramella forsetii(NC008571)相似度為 91%,低于屬內差異(93%),因此也只能判斷兩者為擬桿菌門的某個屬.

只有 Gi-11屬于放線菌門,與金黃節桿菌(Arthrobacter aurescens,NC008711)相似度為98%,可認為是金黃節桿菌(Arthrobacter aurescens).

表1 條紋環溝藻藻際細菌與GenBank上相似菌株16S rDNA V3區序列的相似度比較Table 1 The identities between bacteria isolated from G. instriatum and the closest related sequences from GenBank based on V3 region of 16s rDNA

12株細菌的測序序列與GenBank上13個相似序列的遺傳距離(表2)所反映的結果與相似性一致,各菌株與相似性最高的菌株遺傳距離最近.其中Gi-2、Gi-9和Gi-10與它們最近菌株的遺傳距離超出了屬內差異范疇,而其余菌株與其相近序列間的遺傳距離均小于0.046,屬于種內差異范疇.

2.3 藻際細菌系統發育分析

圖2所示為條紋環溝藻分離得到的12株菌株與GenBank上14個相似度最高的菌株序列之間構建的鄰接系統樹(N-J樹).與表 1的結果相同,26個序列分為α-變形菌綱、γ-變形菌綱、擬桿菌門和放線菌門4個大分支.本研究中的6株α-變形菌與GenBank上6個相似序列以99%的支持率聚為一支,其中 Gi-5、Gi-6和Gi-8與 3個相似序列以 100%的支持率聚為紅桿菌科(Rhodobacteraceae)分支,Gi-7與 1個序列以100%的支持率聚為Polymorphum分支,Gi-2與1個序列以 99%的支持率聚為紅螺菌屬(Rhodospirillum)分支,Gi-3與1個序列以100%的支持率與赤桿菌屬(Erythrobacter)聚成一支.

表2 條紋環溝藻的12株藻際細菌與GenBank上最相似序列之間的遺傳距離Table 2 Genetic distances among 12strains of bacteria isolated from G. instriatum and the closest sequences from GenBank, the shortest distance is marked in bold font

圖2 條紋環溝藻藻際細菌16S rDNA V3序列與GenBank上14個相近序列構建的系統進化樹Fig.2 Phylogenetic tree based on sequences of 16S rDNA V3region of bacteria strains from G. instriatum and fourteen sequences obtained from GenBank. Scale bar=2% difference in nucleotide sequences

3株γ-變形菌與GenBank上5個相似序列以97%的支持率聚為一支,其中Gi-1與1個序列以100%的支持率聚為交替單胞菌屬(Alteromonas),Gi-4與1個序列以100%的支持率聚為海桿菌屬(Marinobacter)分支,Gi-12與1個序列以100%的支持率聚為不動桿菌屬(Acinetobacter)分支.本研究中唯一 1株放線菌 Gi-11與 GenBank上的Arthrobacter aurescens以100%的支持率聚為節桿菌屬(Arthrobacter)一支.2株擬桿菌與GenBank上2個相似序列聚為一支,其中 Gi-9與1個序列聚為Robiginitalea分支,Gi-10與1個序列聚為革蘭菌屬(Gramella)分支.

2.4 藻際細菌菌落結構

由圖 3可見,不同生長時期的條紋環溝藻可培養細菌的種類數為 5～8種之間,其中穩定生長期細菌種類數較為豐富,而在延滯期和衰亡后期細菌種類較少.從各個生長時期的細菌總數來看,延滯期(時期I)細菌數量較低,對數生長期(時期II)細菌數量達到最低,僅為 2.83×106CFU/mL;隨后細菌數量增加,在衰亡前期(時期 IV)細菌數量最高,達到 1.72×109CFU/mL,是其余生長時期細菌數量的 1～2個數量級;衰亡后期雖然細菌數量有所降低,但仍達到1.37×108CFU/mL.

圖3 條紋環溝藻不同生長時期藻際細菌種類數與細菌總數Fig.3 Species number and abundance of bacteria in phycosphere of G. instriatum

圖4 不同生長時期的條紋環溝藻12株藻際細菌數量Fig.4 The abundance of 12 strains of bacteria in different growth stages of G. instriatum

從圖 4可以發現,某些菌株只是特異性出現在某個生長時期或者某一階段,如Gi-4、Gi-6只在延滯期出現,Gi-8只在對數中期出現,Gi-11只在穩定期出現,Gi-12只在衰亡前期出現.Gi-12是衰亡前期的絕對優勢菌群,占細菌總數的96.5%,同時也導致了該時期細菌數量的急劇增加.Gi-12為γ-變形菌綱的鮑氏不動桿菌,該菌的大量出現可能與藻類迅速進人衰亡階段有關.Gi-1和 Gi-3是環溝藻最常見藻際細菌,在每個時期都出現,而且是各生長時期的優勢菌之一,說明它們的存在對藻類生長周期沒有明顯影響.

2.5 條紋環溝藻5個不同生長時期的細菌群落結構的多維尺度和聚類分析

圖5 條紋環溝藻不同時期細菌群落組成聚類分析(A)和多維尺度分析(B)Fig.5 Cluster analysis (A) and multidimensional scaling analysis (B) of bacterial community composition in different growth stages of G. instriatum

圖5中,5個生長時期可分為兩類,時期I、II、III、V聚為一大類,時期Ⅳ單獨成一類.而多維度分析結果同樣顯示,時期II和時期III聚在一起,衰亡前期(時期 IV)與其他生長時期相距均較遠.說明衰亡前期,條紋環溝藻藻際細菌的數量和組成與其他時期差異較大,此結果與不同生長時期藻際細菌菌落結構結果相近(圖3,圖4),衰亡前期的細菌數量明顯高于其他生長時期,細菌數量是其余生長時期的13.2～639倍,而在該時期出現了大量的特異性細菌鮑氏不動桿菌(Gi-12).其余 4個生長時期可分為3類,其中對數生長期(II)和穩定生長期(III)位置較接近,為一類.說明藻細胞快速生長階段菌落結構相近,而衰亡后期(V)和遲滯期(I)菌落組成也有所差異.

3 討論

條紋環溝藻藻際可培養細菌的組成與海洋環境中的常見細菌組成相近,藻際細菌的優勢菌群α-變形菌綱和γ-變形菌綱均為海洋環境中常見細菌類群[19-21].條紋環溝藻藻際細菌組成與其他海洋藻類的藻際細菌組成也具有一定的相似性,如塔瑪亞歷山大藻藻際細菌主要以α-變形菌綱的玫瑰菌屬細菌為主,還包括一些擬桿菌門菌株[5];豐迪亞歷山大藻(Alexandrium fundyense)的藻際細菌主要以γ-變形菌綱為主,包括有交替單胞菌科、假交替單胞菌科、紅桿菌科以及擬桿菌門的黃桿菌科[6];而裸甲藻藻際環境中的可培養細菌以變形菌門細菌(70%)為主,其次為擬桿菌門細菌(26%),還有少量屬于放線菌門[22];Sapp等

[23]在北海赫爾戈蘭島調查中發現一些優勢硅藻和甲藻的藻際細菌多屬于α-變形菌綱、γ-變形菌綱及擬桿菌門中的黃桿菌綱和鞘脂桿菌綱.上述研究報道以及本研究結果都說明海洋浮游植物的藻際細菌多是以變形菌門和擬桿菌門的細菌類群為主.

條紋環溝藻在不同生長時期藻際環境中的細菌數量和群落結構組成呈現不同的特點.在生長旺盛期,細菌數量少,但種類較多;隨著衰亡期的到來,細菌種類減少,但數量大大增加(圖 3,圖4).在藻細胞生長過程中,細菌群落的這種變化與藻類在不同時期的生理狀態有關,同時細菌和藻類也產生相互作用與相互影響[2,24].在赤潮藻消亡過程中,具有溶藻特性的細菌的密度會迅速增加,這可能和藻迅速進入衰亡期有關[8-9].在本研究中,衰亡前期(時期IV)的特異性菌株 Gi-12大量出現,可能與環溝藻細胞迅速進入衰亡期有關.Gi-12為鮑氏不動桿菌(Acinetobacter baumannii),不動桿菌屬的細菌對多種藍藻以及綠藻具有溶藻作用[25-26],然而對海洋微藻的研究作用報道較少.有關該菌與條紋環溝藻生長及赤潮消亡的關系還有待進一步研究.

菌株Gi-3在每個時期都出現,是各生長時期的優勢菌之一,除了衰亡前期外,在其余生長時期均為第一優勢菌群,其在對數生長期、穩定生長期和衰亡后期的比例均超過 80%,說明該菌是條紋環溝藻常見共生菌.Gi-3屬于α-變形菌綱赤細菌屬(Erythrobacter litoralis),目前尚未有該菌或該屬菌株與藻細胞關系的研究報道.

Gi-1雖然不是優勢菌群,但也在各個時期均出現.Gi-1屬于γ-變形菌綱交替單胞菌屬(Alteromonas),而交替單胞菌對多環旋溝藻(Cochlodinium polykrikoides)[27]、中肋骨條藻[28-29]以及海洋卡盾藻[30]均具有明顯溶藻作用.因此,麥氏交替單胞菌的存在可能有利于條紋環溝藻獲得種群競爭優勢,進而促進其赤潮的發生.

4 結論

4.1 條紋環溝藻藻際可培養細菌的組成與海洋環境中的常見細菌組成相近,且與其他海洋藻類的藻際細菌組成有也具有一定的相似性,海洋浮游植物的藻際細菌多是以變形菌門和擬桿菌門的細菌類群為主.

4.2 條紋環溝藻在不同生長時期藻際環境中的細菌數量和群落結構組成呈現不同的特點,衰亡前期的特異性菌株 Gi-12大量出現,可能與環溝藻細胞迅速進入衰亡期有關.

4.3 各個時期均出現的菌株 Gi-1屬于交替單胞菌屬,該菌株可能對條紋環溝藻的種群競爭起作用.

[1]Bell W, Mitchell R. Chemotactic and Growth Responses of Marine Bacteria to Algal Extracellular Products [J]. Biological Bulletin , 1972,143(2):265-277.

[2]Rooney-Varga J N, Giewat M W, Savin M C, et al. Links between phytoplankton and bacterial community dynamics in a coastal marine environment [J]. Microbial Ecology, 2005,49(1):163-175.

[3]Doucette G J, McGovern E R, Babinchak J A, et al. Algicidal bacteria active againstGymnodinium breve(Dinophyceae).I.Bacterial isolation and characterization of killing activity [J].Journal of Phycology, 1999,35 (6):1447–1454.

[4]Hold G L, Smith E A, Rappe M S, et al. Characterisation of bacterial communities associated with toxic and non-toxic dinoflagellates:Alexandriumspp. andScrippsiella trochoidea[J].Microbiology Ecology, 2001,37(2):161-173.

[5]Jasti S, Sieracki M E, Poulton N J, et al. Phylogenetic diversity and specificity of bacteria closely associated withAlexandriumspp. and other phytoplankton [J]. Apply and Environmental Microbiology, 2005,71(7):3483-3494.

[6]Hasegawa Y, Martin J L, Giewat M W, et al. Microbial community diversity in the phycosphere of natural populations of the toxic alga,Alexandrium fundyense[J]. Environmental Microbiology, 2007,9(12):3108-3121.

[7]Kim M C, Yoshinaga I, Imai I, et al. A close relationship between algicidal bacteria and termination ofHeterosigma akashiwo(Raphidophyceae) blooms in Hiroshima Bay, Japan [J]. Marine Ecology Progress Series, 1998,170:25-32.

[8]Liu J Q, Lewitus A J, Kempeton J W, et al. The association of algicidal bacteria and raphidophyte blooms in South Carolina brackish detention ponds [J]. Harmful Algae, 2008,7(2):184-193.[9]Yang Y F, Hu X J, Zhang J, et al. Community level physiological study of algicidal bacteria in the phycospheres ofSkeletonema costatumandScrippsiella trochoidea[J]. Harmful Algae, 2013,28:88-96.

[10]Su J Q, Yang X R, Zheng T L, et al. Isolation and characterization of a marine algicidal bacterium against the toxic dinoflagellateAlexandrium tamarense[J]. Harmful Algae, 2007,6(6):799-810.

[11]王漢奎,黃良民,黃小平,等.珠江海域條紋環溝藻赤潮的生效過程和環境特征 [J]. 熱帶海洋學報, 2003,22(5):55-62.

[12]王朝暉,齊雨藻,尹伊偉,等.1998年春深圳灣環節環溝藻赤潮及其發生原因的探討 [J]. 海洋科學, 2001,25(5):47-50.

[13]王朝暉,姜 珊,谷陽光,等.珠海旋溝藻赤潮水樣對其它微藻生長的影響 [J]. 深圳大學學報理工版, 2011,28(6):553-558.

[14]Jimenz R. Ecological factors related toGyrodinuim instriatumbloom in the inner estuary of the gulf of Guayaquil [C].In:Smayda T J and Shimizu Y, Toxic Phytoplankton Blooms in the Sea. Amsterdam:Elsevier Science Publishers, 1993:257-262.

[15]Nagasoe S, Shikata T, Yamasaki Y, et al. Effects of nutrients on growth of the red-tide dinoflagellateGyrodinium instriatumFreudenthal et Lee and a possible link to blooms of this species[J]. Hydrobiologia, 2010,651(1):225-238.

[16]Hagatrom A, Pinhassi J, Zweifel U L, et al. Biogeographical diversity among marine bacterioplankton [J]. Aquatic Microbial Ecology, 2000,21:231-244.

[17]Hebert P D N, Cywinska A, Ball S L, et al. Biological identification of DNA arrays and barcodes in biodiversity monitoring [J]. Proceedings of the Royal Society B:Biological Science, 2003,270(1512):313-321.

[18]Hajibabaei M, Janzen D H, Burns J M, et al. DNA barcodes distinguish species of tropical Lepidoptera [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2006,103(4):968-971.

[19]Agogue H, Casamayor E O, Bourrain M, et al. A survey on bacteria inhabiting the sea surface microlayer of coastal ecosystems [J]. FEMS Microbiol Ecol, 2005,54(2):269-280.

[20]Eilers H, Penthaler J, Peplies J, et al. Isolation of novel pelagic bacteria from the German bight and their seasonal contributions to surface pioplankton [J]. Applied and Environmental Microbiology, 2001,67(11):5134-5142.

[21]Lee J H, Shin H H, Lee D S, et al. Bacterial diversity of culturable isolates from seawater and a marine coral,Plexauridaesp., near Mun-Sum, Cheju-Island [J]. The Journal of Microbiology, 1999,37(4):193-199.

[22]Green D H, Llewellyn L E, Negri A P, et al. Phylogenetic and functional diversity of the cultivable bacterial community associated with the paralytic shellfish poisoning dinoflagellateGymnodinium catenatum[J]. FEMS microbiology ecology, 2004,47(3):345-357.

[23]Sapp M, Schwaderer A S, Wiltshire K H, et al. Species-specific bacterial communities in the phycosphere of microalgae? [J].Microbial Ecology, 2007,53(4):683-699.

[24]Grossart H P, Levold F, Allgaier M, et al. Marine diatom species harbour distinct bacterial communities [J]. Environmental Microbiology, 2005,7(6):860–873.

[25]彭 超,吳 剛,席 宇,等.3株溶藻細菌的分離鑒定及其溶藻效應 [J]. 環境科學研究, 2003,16(1):37-40.

[26]Rivas M O, Vargas P, Riquelme C E. Interactions ofBotryococcus brauniiCultures with Bacterial Biofilms [J].Microbial Ecology, 2010,60(3):628–635.

[27]Lee B K, Katano T, Kitamura S, et al. Monitoring of algicidal bacterium,Alteromonassp. Strain A14in its application to naturalCochlodiniumpolykrikoidesblooming seawater using fluorescence in situ hybridization [J]. The Journal of Microbiology, 2008,46(3):274-282.

[28]Kato J, Amie J, Murata Y, et al. Development of a genetic transformation system for an alga-lysing bacterium [J]. Applied and Environmental Microbiology, 1998,64(6):2061-2064.

[29]汪 輝,劉 玲,牛丹丹,等.一株海洋細菌對中肋骨條藻的溶藻效應及其溶藻特性 [ J]. 中國環境科學, 2011,31(6):222-227.

[30]Kondo R, Imai I. Polymerase chain reaction primers for highly selective detection of algicidalProteobacteria[J]. Fisheries Science, 2001,67(2):364-366.