一株辛基酚聚氧乙烯醚降解菌的篩選、鑒定及其降解

關向杰,賀強禮,黃水娥,狄 準,楊海君 (湖南農業大學植物保護學院,湖南 長沙 410128)

辛基酚聚氧乙烯醚(OPnEO)類非離子表面活性劑由于性能優良已在工業相關領域得到廣泛應用,隨著大型聚氧乙烯裝置的建成投產和國民經濟的快速增長而成為第二大類非離子表面活性劑.由于辛基酚聚氧乙烯醚及其中間代謝產物具有難降解、疏水性、脂溶性和生物累積等特性,大量使用必然會產生環境污染問題[1-5].OPnEO污染的治理方法很多,如混凝沉降法、泡沫分離法、催化氧化法及活性污泥法等,但最佳的方法是生物降解法[6].關于OPnEO降解菌的研究已有很多報道[7-11],但大多數工作主要集中在降解菌的篩選、降解性能、降解途徑和影響因素等方面.除 2006年日本學者 Tasaki等[12]報道OPnEO降解基因 adh1外,一直沒有關于分子水平上 OPnEO降解機理的研究.本研究從受TX-100(OPnEO,n=9～10)長期污染的制革廢水中分離到一株可利用 TX-100作為唯一碳源的細菌,命名為H1,并利用生理生化和16S rDNA序列分析對其進行鑒定.采用 LC-MS和 UPLC-QTOF-MS對降解產物和降解途徑進行了分析和推測.此外還從分子水平上證實了菌株 H1中存在 TX-100降解性質粒.研究結果為處理環境污染物及進一步從分子水平上克隆與OPnEO降解有關的基因和構建高效降解多種污染物的基因工程菌奠定了基礎.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 培養基 溶菌肉湯培養基(LB):酵母浸出物 5.0g/L,胰蛋白胨 10.0g/L,氯化鈉 10.0g/L,pH7.2.篩選培養基(g/L)[11]:NaCl (0.5), (NH4)2SO4(2.0), MgSO4(0.24), CaCl2(0.01), Na2HPO4(6.8),KH2PO4(3.0),TX-100(1.0),維生素溶液(2mL/L),微量元素溶液(1mL/L).降解培養基(TX-A)[13]培養基成分如下(g/L):NaCl (2.5), (NH4)2SO4(2.0),MgSO4·7H2O (0.3), CaCl2(0.01),Na2HPO4(3.7),KH2PO4(0.9),TX-100(1.0),維生素溶液(2.0mL/L),微量元素溶液(1.0mL/L).維生素溶液成分(mg/100mL):鹽酸吡多辛(10.0),核黃素(5.0),鹽酸硫胺素(5.0),硫辛酸(5.0),對氨基苯甲酸(5.0),葉酸(2.0),維生素H(2.0),維生素Bc(2.0),維生素B12(0.1),過濾滅菌.微量元素溶液的成分(mg/100mL):MnCl2·4H2O(20.0),CoCl2·6H2O(4.0),Na2MO4·2H2O(26.0),FeCl3·6H2O(15.0),配好后經高壓滅菌121℃、20min,備用.

1.1.2 主要試劑 TX-100(純度＞99%)購于Sigma-aldrich公司,主要成分為OP9EO和OP10EO;十二烷基磺酸鈉(純度＞99%)購于深圳鵬程化學試劑有限公司,其余化學試劑均為分析純.

1.1.3 常用儀器 紫外可見分光光度儀(SHIMADZU,UVmin1240,Japan)、電泳儀(北京六一儀器廠,DYY-8C)、PCR擴增儀(ABI,verity,USA)、凝膠成像分析系統(Kodak,Gel Logic 212,USA),高效液相色譜儀(SHIMADZU,LC-20AT,Japan)液相色譜-質譜聯用儀(Agilent, UPLC(1290)-Q-TOF(6530),ACQUITY-SQD,USA)等.

1.2 實驗方法

1.2.1 TX-100降解菌的富集、分離和純化 取皮革廠曝氣池廢水1mL加入到裝有100mL無菌水的三角瓶中,放入恒溫振蕩培養器中,30℃,200r/min振蕩培養 1h,再取 1mL加入到 100mL含1.0g/L TX-100的LB中,30℃、200r/min振蕩培養16h,然后將此菌懸液1mL加入到100mL含1.0g/L TX-100的篩選培養基中,30℃、200r/min振蕩培養24h,將此菌懸液制成10-1到10-7的稀釋液,然后分別取 100μL涂布于篩選培養基平板上,30℃倒置于培養.用接種環挑取其中清晰可見的不同單菌落,在 LB平板上反復劃線分離,得到純菌株.

1.2.2 形態特征鑒定 觀察降解菌菌落的大小、表面形態、光澤度、粘稠度、潤濕情況、隆起和邊緣特征等,顯微鏡觀察菌株大小及形態.

1.2.3 降解菌生理生化特性測定 采用廣州環凱微生物科技有限公司的非發酵細菌鑒定管(產品編號:070150),按照說明書操作.另采用法國梅里埃公司 VITEK 2COMPACT 全自動微生物鑒定藥敏檢測系統儀對降解菌進行快速培養鑒定和藥敏實驗.采用 0.3g/L Cr3+和0.6g/L Cr6+的LB培養基培養H1,檢測該菌對重金屬鉻的耐受性.

1.2.4 16S rDNA序列的鑒定 細菌基因組提取采用天根生化(北京)有限公司細菌基因組DNA 提取試劑盒.方法見說明書.采用上海生工生物工程技術服務有限公司的細菌16S rDNA通用引物(27F:5′AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3′和 1492R: 5′AAGGAGGTGA TCCAGCCGCA3′),以基因組DNA為模板進行16S rDNA的PCR擴增,產物經瓊脂糖電泳檢測后送上海生工生物工程技術服務有限公司測序,并建立系統發育樹.

1.2.5 降解實驗 在無菌條件下,用生理鹽水(NaCl 0.85%)將培養好的菌液離心洗滌 3次,再加入適量生理鹽水振蕩均勻制成OD600=1.0的菌懸液.按照2%的接種量向TX-A培養基中加入制備的菌懸液,然后置于30℃、160r/min振蕩培養14d后,高效液相法(HPLC)測定TX-100的含量,并計算降解率.TX-100降解率=(Cck-Ct)/Cck×100%, Cck為空白處理中TX-100的濃度,Ct為振蕩培養若干天后殘留的TX-100濃度.

1.2.6 TX-100降解率測定和降解產物分析高效液相法(HPLC)測定 TX-100的含量:稱取0.5g TX-100用色譜甲醇溶解并定容到 100mL,作為TX-100的標準儲備液.向系列10mL容量瓶中分別加入 0、0.02、0.10、0.20、0.40、0.60、1.00mL TX-100標準儲備液,用色譜甲醇稀釋至刻度.經 0.22μm 微濾膜過濾后.在 HPLC上進樣測定.樣品前處理:降解培養基中加入等體積的甲醇混勻,取1000μL加入甲醇定容到2mL容量瓶后12000r/min離心30min,過0.22 μm有機濾膜后進高效液相色譜測定TX-100的殘留量.HPLC條件:分離柱:ZORBAX Edipse XDB-C18;流動相:V(甲醇): V(水)=90:10;波長:226nm;紫外檢測器:流速:1.0mL/min;柱溫:26℃.

采用液質聯用(ULPC-MS和UPLC-Q-TOF)測定溶液中 TX-100及其中間產物:將 TX-100標準儲存液用色譜甲醇稀釋到 100μg/L.樣品加入等體積色譜甲醇混勻后取1mL用色譜甲醇稀釋到 100μg/L(ULPC-MS)和 10μg/L(UPLC-QTOF),離心過 0.2μm 有機濾膜后上機,進樣量為10μL.UPLC 條件:Agilent XDB-C18色譜柱;柱溫為35℃,流速為0.25mL/min;流動相A為0.1%甲酸溶液,流動相 B為乙腈,梯度洗脫程序為0～4min,10% B;4～4.1min,80% B;4.1～9min,10%B.UPLC-Q-TOF中UPLC色譜條件:流動相A為0.1%甲酸溶液,流動相B為乙腈,梯度洗脫程序為0～10min,10% B;10～10.1min,95% B;10.1～15min,10% B.質譜條件:采用ES+離子模式,m/z范圍50～1000.Q-TOF條件:采用電噴霧電離離子源 ESI,正離子電離模式,m/z范圍100～1500.

1.2.7 乙醛和乙醛酸的檢測方法 乙醛的檢測采用亞硫酸氫鈉加成法[14],乙醛酸的檢測采用高錳酸鉀滴定法[15].

1.2.8 質粒的檢測 采用全式金生物技術有限公司的質粒小提試劑盒.

1.2.9 質粒的消除 采用系統濃度 SDS法[16]和變溫SDS法[17].采用影印法[18]對能在LB平板上生長,而不能在 TX-A培養基上生長的質粒消除后衍生菌進行質粒檢測和藥敏檢測.

2 實驗結果

2.1 TX-100的標準曲線

以 TX-100(OPnEO, n=9～10)濃度做橫坐標,HPLC測定的峰面積為縱坐標得到如圖 1的標準曲線,R2=0.9997.

2.2 降解菌的分離純化

經過富集、分離和純化,獲得一株能在含1.0g/L高濃度TX-100的無機鹽培養基平板上迅速生長的細菌.同時,對該菌進行降解實驗,經30℃、160r/min培養14d后,TX-100降解率到達81.69%,說明具有降解TX-100的能力,命名為H1.并對該菌進行馴化,采用含TX-100濃度為 1.0,1.5,2.0,2.5,3.0g/L篩選培養基,從低濃度到高濃度逐步馴化后使其可在更高濃度條件下生長.采用甘油保藏法保存菌株 H1于-80℃冰箱.

圖 1 TX-100標準曲線Fig.1 Calibration curve of TX-100solution

2.3 降解菌的鑒定

2.3.1 形態特征鑒定 菌株H1的菌落呈圓形、中間隆起、邊緣整齊、濕潤有光澤、較粘稠.菌株細胞呈短桿狀,有鏈狀排列,革蘭氏染色陰性,有莢膜,無鞭毛和芽孢,其菌落形態、顯微鏡照片見圖2～圖5.

圖2 H1的菌落照片Fig.2 Colonies photos of H1

圖3 H1的莢膜形態Fig.3 The bacterial capsule picture of H1

圖4 H1的掃描電鏡照片Fig.4 SEM image of H1

圖5 H1的透射電鏡照片Fig.5 SEM image of H1

2.3.2 生理生化鑒定 采用廣州環凱微生物科技有限公司的非發酵細菌鑒定管(產品編號:070150),結果見表1.

表1 H1的生理生化鑒定結果Table 1 Results of physiological and biochemical tests of H1

查看非發酵細菌生化鑒定編碼冊,鑒定 H1生理生化特性與醋酸鈣不動桿菌相似性較高,機率為 0.5344,說明該菌株很典型.另外,采用法國梅里埃公司VITEK 2COMPACT全自動微生物鑒定藥敏檢測系統儀對降解菌H1進行快速培養鑒定及藥敏實驗,鑒定 H1藥敏性與魯氏不動桿菌相近,其藥敏結果見表 2.菌株 H1對多種抗生素具有耐受性,這與報道的不動桿菌多具有耐藥性[19-21]是一致的.2種鑒定結果的差異,可能由于本實驗用的全自動微生物鑒定系統的菌種數據庫不全,該數據庫主要針對醫學病原菌.另外,該菌對重金屬鉻有一定耐受性,在 0.3g/L Cr3+和0.6g/L Cr6+的LB培養基中能正常生長.

2.3.3 分子生物學鑒定 菌株H1總DNA的提取按照天根細菌基因組DNA提取試劑盒說明書操作,得到菌株 H1的總 DNA.以菌株 H1的總DNA為模板,利用細菌16S rDNA通用引物進行PCR擴增到片段大小為1500bp左右,經測序得到長為 1451bp的 16S rDNA序列.將已測序列在NCBI上Blast分析,結果顯示H1與Acinetobactersp.具有很高的同源性(大于 97%),并構建系統發育樹,結果見圖 6.根據形態學觀察、生理生化鑒定和16S rDNA同源比對結果,可初步鑒定菌株H1屬于醋酸鈣不動桿菌屬.

表2 H1的藥敏結果Table 2 Results of tests of H1

2.4 降解產物分析

HPLC-MS測定對照和發酵14d后TX-A培養基中 TX-100及其中間產物的濃度,結果見圖7～圖 8.從圖 7、圖 8中 UPLC圖譜可以看出,對照在 4.64min和 4.93min有明顯的峰形出現,而TX-A只有在4.64min有;從對照的MS圖中可以看出,在4.64min和4.93min的峰中, OPnEO分子離子主要分布為m/z427.2693+ 44nEO(nEO=5～13),它們對應[M+H]+,相鄰離子之間間隔一個乙氧基(C2H4O),質量數相差44,而從TX-A的MS圖中未檢測到 OPnEO(n=5～13),說明在 TX-A 中OPnEO已降解,但分析結果未發現相應的中間降解產物,仍需要進一步檢測分析.

采用超高效相液相色譜聯合飛行時間串聯質譜分析降解產物,并分析降解機理.UPLC-QTOF-MS檢測發酵 7d后的 TX-A培養基有OPnEO(n=1～18)存在,14d后的 TX-A 中只有OPnEO(n=10～18)存在,說明環氧乙烷的聚合度越大,越難降解.在7d的TX-A中檢測到OP4EC(圖9),說明有末端氧化現象發生,推測降解先從羥基端 EO氧化開始.這與 Shibata等[31]的發現一致,在好氧條件下Ca2+可使Pseudomonas putidaS-5加速形成辛基酚聚氧乙烯醚乙酸(OPnEC),而不生成辛基酚聚氧乙烯醚(OPnEO).

圖6 根據遺傳距離建立H1的系統發育樹Fig.6 Phylogenetic and molecular evolutionary analyses of H1

圖7 對照培養基中的UPLC和MS圖譜Fig.7 UPLC and MS profile of the contrast medium

在培養7d的TX-A培養基中檢測到乙醛酸的存在,這可能由降解過程中乙醚鏈的斷裂而產生的.結合TX-100降解產物的檢測和分析結果,可以初步推測TX-100的降解先從EO末端逐步氧化,醚鍵斷裂,釋放出乙醚酸,最終形成新的化合物.

2.5 H1質粒提取

采用較溫和的堿裂解法質粒小提試劑盒對H1進行質粒提取,得到較明顯的多條質粒條帶,如圖10所示.

圖8 培養14d后TX-A的UPLC和MS圖譜Fig.8 UPLC and MS profile of TX-A after training 14 days

圖9 OP4EC的MS圖譜Fig.9 MS zoomed spectrum profile of OP4EC

從圖10可以看出,在3～15kb之間有明顯的4條帶,這說明H1的質粒可能有2種或2種以上.這與大多數研究[17,22]不動桿菌的質粒及其耐藥性研究的結果一致,大多數不動桿菌都含有質粒,且有些含有2個或2個以上.此外,研究還發現不動桿菌的耐藥性與質粒有關,部分質粒消除后的不動桿菌會喪失對一些抗生素的抗性,且能夠通過接合方式在細菌之間發生轉移[23].這對不動桿菌質粒與降解能力的研究有一定的指導作用.

圖10 質粒提取與檢測Fig.10 Plasmid extraction and detection

2.6 質粒消除結果

通過影印得到質粒消除后的菌株,結果如圖11所示.

圖 11 LB(左)與 TX-A(右)影印對照Fig.11 Comparative result between LB flat (left) and TX-A flat (right)

H1經過質粒消除處理丟失了質粒,隨機將質粒消除后的H1命名為H1T1、H1T2、H1T3、H1T4和 H1T5.H1T1、H1T2、H1T3、H1T4和H1T5質粒電泳檢測結果見圖12.

由圖 12可見.H1T1、HIT2、H1T3、H1T4和H1T5已檢測不到質粒.而H1的DNA條帶與圖10中H1的DNA條帶大小一致.通過培養發現質粒消除后的衍生菌株與原始菌株相比,其耐受和降解TX-100能力明顯降低,說明TX-100的降解可能和質粒有關.

圖12 質粒消除后檢測結果Fig.12 Detection of plasmid after annihilation

采用法國梅里埃公司 VITEK 2COMPACT全自動微生物鑒定藥敏檢測系統儀對 H1T5進行快速培養鑒定及藥敏實驗,從其藥敏結果可以得出質粒消除前后,H1和H1T5對呋喃妥因、頭孢唑啉、環丙沙星、環丙沙星、頭孢曲松、亞胺培南和左旋氧氟沙星的藥敏度未變,其中對呋喃妥因和頭孢唑啉為耐藥,其它為敏感;對氨芐西林、阿米卡星和復方新諾明的藥敏度由耐藥變為敏感,推測質粒上可能攜帶這些抗生素的抗性基因;對頭孢匹肟、氨芐西林/舒巴坦和氨曲南的藥敏度有變化,但不是很明顯.

3 結論

3.1 從皮革廠污水曝氣池中篩選到一株能夠耐受較高濃度TX-100且降解性能較好的菌株H1,經 30℃、160r/min培養 14d后,H1對 1.0g/L TX-100的降解率可達 81.69%.對該細菌進行了形態學特征、生理生化反應鑒定和16S rDNA序列分析,初步鑒定 H1為醋酸鈣不動桿菌屬(Acinetobacter calcoaceticus).并發現 H1對三價鉻、六價鉻和一些抗生素具有一定的耐受性.

3.2 對降解菌H1降解TX-100的降解產物分析,得出降解過程中產生了 C2H2O3和 OP4EC,可以初步推斷TX-100的降解先從EO末端氧化,醚鍵斷裂,釋放出乙醛酸,逐步縮短聚氧乙醚鏈,最終形成未知化合物.降解菌H1在只有TX-100為唯一碳源的環境下,降解 TX-100過程中不產生環境雌激素效應最強的辛基酚.

3.3 對降解菌 H1進行降解性質粒檢測和質粒消除試驗,表明H1對TX-100的降解與其質粒有關,說明該質粒為降解性質粒.另外,質粒消除后的衍生株對氨芐西林、阿米卡星和復方新諾明的藥敏度由耐藥變為敏感,推測質粒上可能攜帶這些抗生素的抗性基因.

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