一株苯乙烯高效降解菌的分離鑒定及降解特性研究

於建明,劉 靚,蔡文吉,成卓韋,陳建孟,蔣軼鋒* (.浙江工業(yè)大學(xué)長(zhǎng)三角綠色制藥協(xié)同創(chuàng)新中心,浙江杭州 3004；.浙江工業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院,浙江 杭州 3004)

苯乙烯為無(wú)色透明油狀液體,有毒,難溶于水,能溶于醚類及醇類,作為一種重要的化工原料而廣泛用于塑料、合成橡膠、樹(shù)脂等生產(chǎn)中[1].伴隨苯乙烯的生產(chǎn)、運(yùn)輸、使用、貯藏過(guò)程,會(huì)有較大量苯乙烯進(jìn)入大氣和水體,造成大氣和水體的污染及危害人體健康[2].近年來(lái),微生物降解法以反應(yīng)條件溫和、降解徹底、運(yùn)行費(fèi)用低、無(wú)二次污染等優(yōu)點(diǎn)受到廣泛重視[3-5].目前,已報(bào)道的苯乙烯降解菌主要有Actinomycetes[6],Pseudomonas fluorescensST[7],Pseudomonassp. SR-5[8],Rhodococcuspyridinovorans[9],Pseudomonas putidaSN1[10],Brevibacillussp.[11]等.

本文采用唯一碳源篩選的方法,從橡膠廠的活性污泥中分離出一株苯乙烯高效降解菌,對(duì)其生長(zhǎng)特性進(jìn)行試驗(yàn)分析,考察該菌株在不同條件下(溫度、pH值、初始濃度等)對(duì)苯乙烯的降解能力.通過(guò)降解動(dòng)力學(xué)研究,優(yōu)化其降解苯系物能力,為解決苯乙烯的污染問(wèn)題提供一定的基礎(chǔ)數(shù)據(jù).

1 材料與方法

1.1 樣品來(lái)源

篩選菌株的樣品取自杭州某橡膠廠曝氣池活性污泥.經(jīng)分析,活性污泥的混合液懸浮固體濃度(MLSS)為 8437mg/L,污泥容積指數(shù)(SVI)為123.4mL/g,有效活菌數(shù)為3.48×1010CFU/mL.

1.2 培養(yǎng)基類別

無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基(g/L):KH2PO40.376,K2HPO4·3H2O 0.456, (NH4)2SO40.484, NaNO30.68, Mg(NO3)20.256, CaCl20.011,微量元素(MnCl2·H2O 0.06, ZnCl20.088, KI 0.01,NaMoO4·2H2O 0.1, H3BO30.05),蒸餾水 1000mL,pH值7.0; 110℃滅菌40min,添加一定量苯乙烯作為唯一碳源.

LB固體培養(yǎng)基(g/L):蛋白10,酵母浸5, NaCl 5,瓊脂 18,蒸餾水 1000mL.pH 值 7.0,121℃滅菌20min.

無(wú)機(jī)鹽固體培養(yǎng)基:無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中加入瓊脂(18g/L),121℃滅菌 20min后取用,倒至培養(yǎng)皿待冷卻制成固態(tài)平板培養(yǎng)基,將無(wú)菌的棉花置于培養(yǎng)皿中,定時(shí)向棉花上添加一定量苯乙烯作為碳源.

1.3 主要儀器與試劑

全自動(dòng)微生物鑒定儀(Biolog,美國(guó));3S柱離心式環(huán)境DNA回收試劑盒V2.2(申能博彩,上海);PCR擴(kuò)增儀(Bio-rad,美國(guó));氣相色譜(Agilent 6890,美國(guó));分光光度計(jì)(HITACHI U-2910,日本);熒光-光學(xué)顯微鏡(Nikon DS-Fi1,日本);電子天平30℃、160r/min的搖床富集培養(yǎng)轉(zhuǎn)接.取一定量鹽水瓶中的菌液進(jìn)行梯度稀釋,并涂布至配好的無(wú)機(jī)鹽固體篩選培養(yǎng)基中,30℃培養(yǎng) 3～4d后,挑取培養(yǎng)平板上的單菌落,接入添加苯乙烯的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中,置于 30℃,160r/min的搖床中培養(yǎng),經(jīng)反復(fù)篩選,最后篩選出一株具有高效降解苯乙烯能力的菌株,并于4℃ LB斜面保藏.(Sartorius BT224S,北京);便攜式 pH 計(jì)(WTW 330i,德國(guó));苯乙烯(巨化,衢州);衍生化試劑:吡啶(阿拉丁,上海)、BSTFA(百靈威,上海).

1.4 菌株分離純化

將曝氣池活性污泥置于棕色廣口瓶中,以苯乙烯為唯一碳源并同時(shí)曝氣馴化數(shù)周后,從廣口瓶取5mL活性污泥至含有50mL無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基的密封培養(yǎng)瓶中,加入 200mg/L的苯乙烯,置于

1.5 菌株鑒定

菌株的生理生化試驗(yàn)方法參考《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[12].Biolog試驗(yàn)方法參考文獻(xiàn)[13-14],采用GN3通用碳源鑒定板.

采用3S柱離心式環(huán)境樣品DNA回收試劑盒 V2.2(申能博彩生物科技有限公司,上海)提取菌株的 DNA.主要流程包括:破裂細(xì)菌細(xì)胞膜和細(xì)胞壁、去除蛋白質(zhì)、DNA沉淀及DNA純化.選用細(xì)菌通用引物BSF8/20和BSR1541/20(寶生物工程有限公司,大連)[15]進(jìn)行PCR擴(kuò)增[16].擴(kuò)增后產(chǎn)物委托杭州華大基因研發(fā)中心測(cè)序,利用BLAST將測(cè)得的基因序列與GenBank內(nèi)的16S rRNA基因序列進(jìn)行同源性比對(duì)分析[17],選取1400bp左右長(zhǎng)度進(jìn)行比對(duì)[Clustelx(1.83)],采用鄰位連接(NJ)法進(jìn)行系統(tǒng)學(xué)分析[MEGA(5.1)],確定菌株的屬種情況并命名.

1.6 菌株降解特性考察

1.6.1 環(huán)境因素對(duì)降解效率的影響 采用“單因素試驗(yàn)法”分別考察溫度、pH值對(duì)菌株降解苯乙烯效率的影響,單因素設(shè)置如下:控制pH值7.0,溫度為 25、27.5、30、32.5、35、37.5、40℃;控制溫度為 30℃,pH 值為 4、5、6、7、8、9、10.取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌液離心洗滌后懸浮于磷酸緩沖溶液中(0.05mol/L,pH值7.0).取250mL玻璃培養(yǎng)瓶中加入 50mL無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基,并向其中加入上述的菌懸液(控制培養(yǎng)液初始生物量18.2mg/L)和 200mg/L 的苯乙烯,橡膠塞密封,置于不同條件下連續(xù)培養(yǎng),同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組(不添加菌液),定時(shí)測(cè)定培養(yǎng)液中殘留的苯乙烯和生物量.

1.6.2 苯乙烯初始濃度對(duì)降解效率的影響 將上述的菌懸液(控制培養(yǎng)液初始生物量18.2mg/L)加入含50mL無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)液(pH值7.0)的250mL培養(yǎng)瓶中,并分別向其中加入一定量液態(tài)苯乙烯,控制其初始濃度分別在25、50、100、200、300、500、800、1000、1500、2000mg/L 濃度,橡膠塞密封,置于 30℃,160r/min的搖床中連續(xù)培養(yǎng),同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組,定時(shí)測(cè)定培養(yǎng)液中殘留的苯乙烯和生物量.

1.6.3 菌株對(duì)多種碳源的降解能力 將上述的菌懸液(控制培養(yǎng)液初始生物量 18.2mg/L)加入含50mL無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)液的250mL培養(yǎng)瓶中,并分別加入等濃度(200mg/L)的苯、甲苯、乙苯、鄰二甲苯、間二甲苯、對(duì)二甲苯、氯苯、正己烯及二氯甲烷等工業(yè)中常見(jiàn)的有機(jī)污染物.橡膠塞密封,置于 30℃,160r/min的搖床中連續(xù)培養(yǎng),同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組,定時(shí)測(cè)定培養(yǎng)液中殘留的底物量和生物量.

1.7 分析方法

1.7.1 苯乙烯殘留濃度分析 采用氣相色譜對(duì)搖瓶?jī)?nèi)的氣相苯乙烯濃度進(jìn)行定量分析,色譜柱為 HP-Innowax 毛細(xì)管柱(30m×320μm×0.5μm),進(jìn)樣口和檢測(cè)器(FID)的溫度分別為 250℃和300℃,柱溫為 155℃,N2載氣,柱流速 2mL/min,進(jìn)樣體積 600μL.液相中苯乙烯濃度經(jīng)正己烷萃取后亦采用氣相色譜進(jìn)行分析,色譜柱為HP-Innowax毛細(xì)管柱,進(jìn)樣口和檢測(cè)器(FID)的溫度分別為250℃和300℃.采用程序升溫: 70℃維持3min,30℃/min升溫至155℃維持3min. N2載氣,柱流速2mL/min,進(jìn)樣體積2.0μL.

1.7.2 菌體生物量測(cè)定 采用分光光度計(jì)測(cè)定菌液在600nm波長(zhǎng)處的吸光度值(OD600)及電子天平測(cè)定菌液對(duì)應(yīng)濃度下的細(xì)胞干重,用定量濾紙濾過(guò)該菌懸液后,置于95℃恒溫烘箱烘至恒重,測(cè)量濾紙前后的質(zhì)量變化即為細(xì)胞干重量,繪制吸光度與細(xì)胞干重關(guān)系標(biāo)準(zhǔn)曲線,然后根據(jù)不同吸光度值計(jì)算細(xì)胞干重(mg/L).

1.7.3 中間產(chǎn)物分析 采用 GC-MS(Agilent6890-5973N),色譜柱為 HP-5毛細(xì)管柱(30m×0.32mm×0.25μm),定時(shí)對(duì)搖瓶中的培養(yǎng)液經(jīng)萃取、衍生化[18]后的樣品進(jìn)行檢測(cè).檢測(cè)條件:載氣為氦氣,柱流速為 1.0mL/min.柱溫采用升溫程序:初始溫度為60℃,保留2min,20℃/min升高到280℃,保留2min;進(jìn)樣口溫度為250℃,進(jìn)樣采用不分流模式,進(jìn)樣量為1.0mL;四級(jí)桿150℃,輔助通道溫度250℃,溶劑延遲時(shí)間為2min,電離方式為EI,離子源溫度為230℃.

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株鑒定

2.1.1 生理生化試驗(yàn) 通過(guò)分離純化,篩選出一株具有高效降解苯乙烯能力的菌株,命名為 WJ.該菌株在無(wú)機(jī)鹽固體培養(yǎng)基30℃培養(yǎng)48h后,形成透明、表面光滑、邊緣整齊的菌落.透射電鏡觀察(圖1),該菌株多鞭毛、呈橢球狀、大小約為0.9μm×2.2μm;菌株革蘭氏染色為陰性,結(jié)果見(jiàn)表1,結(jié)合伯杰氏手冊(cè)中關(guān)于假單胞菌形態(tài)和特性的描述,初步確定該菌株屬于假單胞菌屬(Pseudomonassp.).

表1 菌株WJ的生理生化特性Table 1 Physiological and biochemical characteristics of strain WJ

2.1.2 16S rRNA基因序列分析 菌株 WJ的16S rRNA基因經(jīng)PCR擴(kuò)增和測(cè)序后,上傳序列至 GenBank,獲得該菌株的基因序列登錄號(hào)(JX569146),與 GenBank內(nèi)已知基因序列進(jìn)行同源比對(duì)分析,建立系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),確定其發(fā)育關(guān)系,確定該菌株與Pseudomonas putidastrain1589[JN679854]的可信度達(dá) 91%,結(jié)合菌株生理生化特性,可以確定該菌株屬于Pseudomonas屬.該菌株WJ保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC),保藏號(hào)為M 2012295.

圖1 菌株WJ的透射電鏡圖Fig.1 TEM photo of strain WJ

2.1.3 菌株Biolog鑒定 采用GN3通用碳源鑒定板分析菌株對(duì)95種碳源的利用能力,將鑒定結(jié)果與Biolog系統(tǒng)數(shù)據(jù)庫(kù)(V5.2.01)進(jìn)行比對(duì),進(jìn)一步確定其屬種情況,進(jìn)而提高鑒定結(jié)果的可靠性.30℃培養(yǎng)22h后菌株WJ比對(duì)結(jié)果表明其屬于Pseudomonas putida,SIM值為0.831(臨界值為0.75)[19],為良好匹配,且 Biolog所得鑒定結(jié)果與16S rRNA分析結(jié)果一致,最終可確定菌株WJ屬于Pseudomonas putida.

2.2 溫度與pH值對(duì)菌株降解效率的影響

在不同溫度下培養(yǎng) 20h后測(cè)得培養(yǎng)液中殘留的苯乙烯和生物量(圖 2).結(jié)果表明,不同溫度下苯乙烯降解率和菌株 WJ生物量 (mg/L)具有明顯差異,生物量和降解率隨著溫度的升高而逐漸升高,但溫度高于一定值(30℃)后,降解率和生物量反而下降.這是由于微生物的降解過(guò)程一般為酶促反應(yīng),溫度低時(shí)菌株生長(zhǎng)緩慢、代謝活性差,隨著溫度的升高,酶的活性隨之增加,當(dāng)溫度超過(guò)最適宜溫度范圍之后,酶就逐漸變性和失去活性,從而影響對(duì)底物的降解效率[20].在本試驗(yàn)條件下,當(dāng)溫度30℃時(shí),菌株WJ生長(zhǎng)最快,生物量達(dá)到 101.38mg/L,菌株對(duì)苯乙烯的降解率最大達(dá)到99.3%,表明30℃為該菌株的最適生長(zhǎng)溫度.

在不同pH值下培養(yǎng)20h后測(cè)得培養(yǎng)液中殘留的苯乙烯和生物量(圖3)可知,當(dāng)培養(yǎng)液pH值為4和10時(shí),菌株基本不能降解苯乙烯,且生物量減少.菌株在pH值5～9的范圍內(nèi)均能生長(zhǎng),且pH值呈中性時(shí),菌體生長(zhǎng)穩(wěn)定和苯乙烯降解效率高,可見(jiàn)培養(yǎng)液的酸堿度對(duì)生物降解有明顯影響.當(dāng)溶液中pH值超過(guò)生物酶的適應(yīng)范圍就有可能改變酶蛋白結(jié)構(gòu),從而抑制酶的活性.在 pH值為 7時(shí),菌株WJ的生長(zhǎng)和降解速率最快,對(duì)苯乙烯的去除率達(dá)到95.77%,生物量達(dá)到102.5mg/L,表明最適宜菌株WJ生長(zhǎng)和降解苯乙烯的pH值是7,該結(jié)果與文獻(xiàn)[10]報(bào)道的Pseudomonas putidaSN1菌株最佳生長(zhǎng)的pH值和溫度一致.

圖2 溫度對(duì)菌株WJ降解苯乙烯及其生長(zhǎng)速率的影響Fig.2 Effects of temperature on styrene degradation and the growth of strain WJ

圖3 pH值對(duì)菌株WJ降解苯乙烯及其生長(zhǎng)速率的影響Fig.3 Effects of pH on styrene degradation and the growth of strain WJ

2.3 菌株WJ底物寬泛性研究

實(shí)際工業(yè)廢氣往往是多組分的有機(jī)污染物共存,因此考察菌株 WJ對(duì)其他污染物的降解能力尤為重要,菌株對(duì) BTEX、氯苯、正己烯及二氯甲烷等工業(yè)中常見(jiàn)的污染物降解情況見(jiàn)表 2.結(jié)果表明,菌株WJ能不同程度地降解苯、甲苯、乙苯、二甲苯等 BTEX,以及正己烯等碳?xì)浠衔?但基本不能利用氯苯、二氯甲烷等鹵代烴.

微生物對(duì)污染物降解情況往往取決于有機(jī)污染的分子結(jié)構(gòu)、化學(xué)穩(wěn)定性[21],以BTEX為代表的苯環(huán)類和正己烯為代表的烯烴類化合物是與苯乙烯結(jié)構(gòu)類似的物質(zhì),菌株具有相關(guān)酶系能有效氧化分解這些物質(zhì),因此菌株能不同程度地降解這些物質(zhì),而氯苯、二氯甲烷類等鹵代烴由于 C-Cl鍵能極大,致使生物降解此類物質(zhì)較為困難.該菌株能降解部分常見(jiàn)的工業(yè)廢氣,尤其是對(duì)于與苯乙烯結(jié)構(gòu)類似的物質(zhì)具有良好降解能力,表明該菌株具有良好的底物寬泛性.

表2 菌株WJ對(duì)于不同碳源的降解能力與生物量Table 2 Biodegrading ability and biomass of different carbon sources by WJ strain

2.4 不同初始濃度苯乙烯對(duì)菌株降解效率的影響

圖4 菌株WJ對(duì)不同初始濃度苯乙烯的降解曲線Fig.4 Styrene degradation by strain WJ at different initial concentration

苯乙烯作為一種有機(jī)污染物,具有一定的生物毒性,過(guò)高濃度的苯乙烯可能會(huì)致使微生物細(xì)胞發(fā)生遺傳毒性變異及毒害細(xì)胞正常的代謝,并干擾降解輔酶的再生過(guò)程[22].在最佳生長(zhǎng)條件下,考察菌株 WJ對(duì)不同初始濃度苯乙烯的降解特性(圖4),結(jié)果表明菌株WJ能完全降解濃度低于1500mg/L的苯乙烯,在此范圍內(nèi)隨著濃度(＞500mg/L)的增加,菌株降解適應(yīng)期開(kāi)始趨長(zhǎng)[23];當(dāng)苯乙烯濃度達(dá)到 2000mg/L時(shí),菌體細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入明顯的停滯期,且20h后生物量開(kāi)始消亡,這種由于高濃度底物引起菌株滯后生長(zhǎng)的影響并毒害細(xì)胞的現(xiàn)象稱為底物的抑制作用.Babaee等

[24]報(bào)道的生物徹底降解初始苯乙烯濃度為69.25mg/L需要 25h,在初始苯乙烯濃度為 150～200mg/L時(shí)即出現(xiàn)大幅的滯后期,而本試驗(yàn)篩選到的菌株WJ在耐受濃度、降解性能上均優(yōu)于上述文獻(xiàn)報(bào)道的菌株.

2.5 菌株WJ降解苯乙烯的動(dòng)力學(xué)

Haldane’s方程是最常用的細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型之一[25],采用該模型對(duì)菌株 WJ降解不同初始濃度苯乙烯過(guò)程進(jìn)行擬合,其表達(dá)式如下[26-28]:

式中:v為菌株比降解速率,h-1;X為菌濃度,mg/L;S為底物濃度,mg/L;t為時(shí)間,h;vmax為最大比降解速率,h-1;Ks為半飽和系數(shù),mg/L;Ki為抑制系數(shù),mg/L.

菌株WJ以苯乙烯為底物的Haldane’s方程擬合曲線如圖5所示,隨著苯乙烯濃度的增加,比降解速率逐漸增大,在苯乙烯濃度為200mg/L時(shí)達(dá)到最大值,隨著苯乙烯濃度的繼續(xù)增加,比降解速率逐漸下降.這可能是由于低濃度苯乙烯培養(yǎng)基中碳源不足以供應(yīng)微生物生存,而高濃度苯乙烯溶液表現(xiàn)出底物抑制作用.所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與模型預(yù)測(cè)具有較高的相關(guān)系數(shù)R2=0.955,菌株 WJ降解苯乙烯過(guò)程中的 Haldane’s方程動(dòng)力學(xué)參數(shù):vmax=0.282h-1,Ks=23.57mg/L,Ki=1784.56mg/L,Ki越高,底物抑制作用越不明顯,表明菌株 WJ對(duì)苯乙烯具有良好的耐受性和降解性.

圖5 菌株WJ降解苯乙烯的比降解動(dòng)力學(xué)曲線Fig.5 Specific degradation kinetics curve for the strain WJ degrading styrene

2.6 菌株WJ降解苯乙烯的途徑

圖6 菌株WJ降解苯乙烯的中間產(chǎn)物GC-MS檢測(cè)結(jié)果Fig.6 The GC-MS detection result of styrene intermediates that degraded by Strain WJ

利用GC-MS對(duì)該菌株WJ降解苯乙烯的衍生化產(chǎn)物分析,檢測(cè)獲得幾種降解產(chǎn)物如圖 6所示,依次為氧化苯乙烯、苯乙醛、苯乙酸.吳獻(xiàn)花等[29]研究指出苯乙烯微生物需氧降解的兩條主要途徑包括乙烯基側(cè)鏈的氧化和芳香環(huán)開(kāi)裂(圖7),圖中實(shí)線已被證實(shí),虛線表示還需進(jìn)一步證明的.中間代謝產(chǎn)物,結(jié)果表明該菌株降解苯乙烯的可能氧化途徑為乙烯基側(cè)鏈的氧化,與文獻(xiàn)[29-30]報(bào)道的乙烯基側(cè)鏈的氧化途徑相一致,這可能是由于該菌株氧化乙烯基的能力強(qiáng)于氧化芳香環(huán)開(kāi)環(huán)能力,對(duì)苯乙烯的乙烯基側(cè)鏈的生物氧化途徑做了進(jìn)一步的驗(yàn)證.

圖7 苯乙烯生物降解的主要途徑Fig.7 The main biodegradation pathways of styrene

3 結(jié)論

3.1 篩選得到的一株能以苯乙烯為唯一碳源和能源的高效降解菌株 WJ,經(jīng)生理生化試驗(yàn)、Biolog鑒定和16S rRNA基因發(fā)育樹(shù)等方法鑒定該菌株為Pseudomonas putida.

3.2 菌株 WJ較適宜的培養(yǎng)條件為:溫度 30℃,pH值7,該條件下對(duì)菌株生長(zhǎng)和對(duì)降解苯乙烯效率有明顯的促進(jìn)作用,菌株能完全降解初始濃度為 0～1500mg/L的苯乙烯,但當(dāng)苯乙烯初始濃度為2000mg/L時(shí),菌體生長(zhǎng)代謝則受到明顯抑制.

3.3 菌株WJ的降解動(dòng)力學(xué)符合Haldane’s模型,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與模型預(yù)測(cè)具有較高的相關(guān)系數(shù)R2=0.955,相應(yīng)的動(dòng)力學(xué)參數(shù)為:vmax=0.282h-1,Ks=23.57mg/L,Ki=1784.56mg/L.

3.4 菌株WJ寬泛性試驗(yàn)表明,菌株對(duì)于BTEX,正己烯等與苯乙烯結(jié)構(gòu)類似的碳?xì)浠衔锞哂辛己玫慕到饽芰?但對(duì)氯苯、二氯甲烷等鹵代烴則基本不能利用.

3.5 GC-MS檢測(cè)結(jié)果表明,菌株 WJ氧化降解苯乙烯的主要可能途徑為乙烯基側(cè)鏈的氧化,這可能是由于該菌株氧化乙烯基的能力強(qiáng)于氧化芳香環(huán)的能力.

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